《生物化学教学课件》第十四章dna的生物合成-刘皓

第三篇遗传信息的传递第十九章细胞信号转导的分子机制,主要内容,刘皓email:737162293生物化学与分子生物学教研室,第三篇遗传信息的传递,DNA复制、转录和翻译基因表达调控基因重组与基因工程,（1958，F.Crick）,Reversetranscription(1970,H.Temin),第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(DNAReplication),复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,主要内容,复制的基本特征DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的过程逆转录和其他复制方式DNA损伤（突变）与修复,复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication,第一节,半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication),复制的基本特征,一、半保留复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律指导合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。由于碱基互补，两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,N15-yellowstrandN14-blackstrand,G0G1G2,heavy,intermediate,light,Meselson-Stahlexperiment,DNAcentrifugedinCesiumChloride,heavyDNAsettleslowerintube,RP5,N15-DNA,N14-DNA,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,复制的分子基础：碱基配对规律和DNA双螺旋结构,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、双向复制,复制时，DNA从特定的起始点(origin，ori)开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制叉(replicationfork)：复制时DNA双链解开成双股，各自作为模板，子链沿模板延长时所形成的一种字形结构。,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、半不连续复制,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(laggingstrand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第二节,TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication,DNA复制的反应体系:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,参与DNA复制过程的酶或蛋白质因子：a.DNA聚合酶(DNApolymerase)b.与DNA解旋和解链有关的酶：解螺旋酶(Helicase)引物酶(Primase)拓扑酶(DNAtopoisomerase)单链DNA结合蛋白(Single-strandDNA-bindingprotein,SSB)c.DNA连接酶(DNAligase),一、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol,1.复制的基本化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,DNA聚合酶的作用特点:,以四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)作底物；需要接受模板的指导;DNA新链生成需引物3-OH的存在；新链的延长只可沿53方向进行。,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol(1958,A.Kornberg)DNA-polDNA-pol,DNA-pol（109kD）,323个氨基酸,小片段,5核酸外切酶活性,大片段/Klenow片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性,N端,C端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,35外切酶活性:,53外切酶活性:,?,切除引物和突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,DNA-pol功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol（120kD）,DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：,DNA-pol(250kD),是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,核心酶：，和亚基,/ross/workmg/Replication1Ch5.htm,原核生物的DNA聚合酶,共性：都具有5-3聚合酶活性和3-5核酸外切酶活性,（二）真核细胞DNA聚合酶：五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,(三)DNA聚合酶与复制的保真性(fidelity),复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,a.核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,DNApol的校读功能,b.复制的保真性依赖正确的碱基选择,错配碱基之间难以形成氢键DNA聚合酶对核苷酸的参入有选择功能,遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,二、与DNA解旋与解链有关的酶,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E.Coli基因图,1.解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。2.引物酶(primase)复制起始时催化游离NTP聚合生成RNA引物的酶。3.单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。SSB与DNA单链的结合表现出协同效应。,4.DNA拓扑异构酶:改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,三、DNA连接酶,催化互补双链DNA中单链切口处的相邻3-OH末端和5-P末端之间生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNAligase)作用方式：,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶并不能连接单独存在的单链DNA缺口，它所连接的都是在碱基互补的基础上的缺口。DNA连接酶也可连接DNA两股链都有的缺口，但缺口的碱基必须互补。,a.DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。b.在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。c.也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication,第三节,（一）复制起始：DNA解链形成引发体,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点oriC,1.DNA解链,富含AT区,识别区,DnaA,DnaB、DnaC,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2.引发体(primosome)和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,复制起始的顺序DnaA辨认结合Ori识别区，几个DnaA蛋白相互靠近，并使富含AT区开链DnaC协同DnaB进入起始部位DnaA进一步解链,SSB与解开的单链结合引物酶（DnaG）进入形成引发体以NTP为原料,从53合成RNA引物DNAPOL催化第一个dNTP加到RNA引物的3/-OH上,（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,随从链的合成,解链方向,同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,随从链上不连续性片段的连接：,复制过程简图,二、真核生物的DNA合成,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点：,a.由末端单链DNA序列和蛋白质构成。b.末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),组成：,端粒酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。,逆转录和其他复制方式ReverseTranscription自然进化过程中，生物进化出一套极其复杂又高度协调的DNA损伤监控和修复系统，以分别应对和修复种类繁多的DNA损伤,DNA损伤的修复(repairing)是纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。,直接修复切除修复重组修复SOS修复,修复的主要类型：,（一）直接修复,光修复酶(photolyase),UV,嘧啶二聚体的光复合修复,（二）切除修复:生物界最普遍的一种DNA修复方式,碱基切除修复核苷酸切除修复碱基错配修复,托马斯林达尔完成了“碱基切除修复”的拼图,在此位点的5末端，