第2章蛋白质的构件-氨基酸.ppt

第二章蛋白质的构件氨基酸,1838年荷兰科学家G.J.Mulder首先提出“protein”这个名词，“protein”来自希腊文是第一的、最重要的意思。蛋白质是生物体内的最重要的物质1蛋白质存在于所有的生物细胞中，约占细胞干重的50%以上。2蛋白质是细胞原生质的主要成分，原生质是生命的物质基础。,一蛋白质的化学组成和分类蛋白质主要含有C、H、O、N以及S元素。N元素是蛋白质的特征性元素，根据对大多数蛋白质的N元素分析，其含量相近，一般在1517%，平均为16%。凯氏微量定氮法就是利用这个原理。蛋白质含量=蛋白氮6.25,酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。,蛋白质的分类,（1）按组成,简单蛋白结合蛋白,（2）按分子外形的对称程度,球状蛋白质纤维状蛋白质膜蛋白质,（3）按功能,简单蛋白质：只有氨基酸通过肽键连接起来的大分子称为简单蛋白质，例如：溶菌酶、肌动蛋白核糖核酸酶A等。,结（缀）合蛋白质：蛋白质分子中除含有氨基酸外还有其它的有机物作为结构部分。例如肌红蛋白、细胞色素C等。非蛋白部分称为辅基或配体配基。,（1）酸水解：盐酸或硫酸。完全水解生成氨基酸。色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基转变为相应的天冬氨酸和谷氨酸。,二蛋白质的水解,（2）碱水解：通常用NaOH进行完全水解。色氨酸不受破坏，然而水解过程生成的氨基酸遭受不同程度的破坏。产生消旋现象。产物中D-和L-氨基酸等量混和，称为消旋物,（3）酶水解：水解位点特异，作用时间比较长，需要几种酶协同作用，才能使蛋白质彻底水解，主要用于一级结构分析。不产生消旋，也不破坏任何氨基酸。常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜蛋白酶）、弹性蛋白酶以及胃蛋白酶等,三-氨基酸的结构通式,由蛋白质水解生成的常见氨基酸只有20种。除脯氨酸外，其它19种氨基酸在结构上都有共同点：羧基所连的碳原子（C）上连接一个氨基，所以称为氨基酸。连接在碳原子上还有一个可变的侧链基团，称R基，最简单的是一个氢原子，不同的氨基酸的区别就在与R基不同。,-氨基酸的结构通式,氨基酸在中性（pH7）溶液中，以兼性离子状态存在:,氨基酸除R基为氢的甘氨酸外，其它19种氨基酸的碳原子都是手性碳原子，这些氨基酸具有D型和L型两种，组成蛋白质的氨基酸都是L型的。,C是不对称碳原子（除Gly），则：,（1）具有两种立体异构体D-型和L-型,（2）具有旋光性左旋（-）或右旋（+）,（3）组成天然蛋白质的氨基酸都是L-型。,四氨基酸的分类,（一）常见的蛋白质氨基酸基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）组成蛋白质，20种。1脂肪族15种：中性氨基酸5种含羟基或硫的氨基酸4种酸性氨基酸及其酰胺4种碱性氨基酸2种,2杂环氨基酸2种组氨酸的侧链是咪唑基也属于碱性氨基酸,脯氨酸结构特殊。Pro的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。,3芳香族氨基酸（3种）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸苯丙氨酸：R基为苯环。酪氨酸：R基为对羟苯基。色氨酸：R基为吲哚基特点：这三种氨基酸具有紫外吸收，色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）在280nm附近，吸收最强；苯丙氨酸（Phe）在259nm附近，吸收最强。因为每种蛋白质中都含有这三种氨基酸，紫外吸收法测定蛋白质含量就是根据样品在280nm附近，紫外吸收值。,在维持蛋白质的三维结构中起着重要（蛋白质的疏水核心）。,（1）非极性氨基酸8种,这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水,（2）不带电何的极性氨基酸7种,（3）带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)2种,（4）带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)3种,按照R基的极性性质分为4类,按照R基的极性性质分为4类,（二）不常见的蛋白质氨基酸：也称稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸经酶促修饰而来。,这些氨基酸是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来所以也称修饰氨基酸。,（1）4-羟脯氨酸（2）5-羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。（3）6-N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中（4）-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素存在于甲状腺蛋白中（6）锁链素由4个Lys组成存在于弹性蛋白中,-Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）,（三）非蛋白质氨基酸(约150种)。,不组成蛋白质，但有生理功能的氨基酸,L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物,L-型氨基酸的衍生物,D-型氨基酸,D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）,-、-、-氨基酸,五氨基酸的酸碱化学（一）氨基酸的解离：氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在。,（1）pKa/就是HA50%解离（碱=酸）时溶液的pH值。,（2）当HA50%解离时，溶液的pH值等于pKa/,（3）pH=pKa/时，碱=酸（50%解离）pHpKa/时，碱酸（50%解离）pH碱（50%解离）,氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线,甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）,Gly等电点的计算,甘氨酸的滴定曲线,谷氨酸的滴定曲线,赖氨酸的滴定曲线,2,2,2,),3,(,),(,),3,(,),(,R,NH,R,COOH,NH,COOH,pK,pK,pI,pK,pK,pI,pK,pK,pI,+,=,+,=,+,=,-,-,-,-,a,a,a,a,中性氨基酸,碱性氨基酸,酸性氨基酸,氨基酸等电点的计算,pK1pK2pK（侧链）pICOOH-NH3+RVal:2.299.74?Lys：2.169.0610.54?Glu:2.109.474.07?,氨基酸等电点的计算对于中性氨基酸：pI=(pKa1+pKa2)1/2对于酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKaR)1/2对于碱性氨基酸：pI=(pKa2+pKaR)1/2,(一)-羧基反应1脱羧基反应：氨基酸脱去羧基生成相应的胺。2成酯反应：在适当条件下（适当的醇和强酸），例如在无水乙醇中通入盐酸，然后回流，氨基酸转变为氨基酸乙酯。,六氨基酸的化学性质,3成酰氯反应：氨基酸的-羧基容易与五氯化磷或二氯亚砜生成酰氯。活化羧基，可用于肽的人工合成,1、与亚硝酸反应,（二）-NH2参加的反应,苄氧甲酰氯叔丁氧甲酰氯对-甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐,2、与酰化试剂反应,氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。,酰化试剂,酰化试剂在多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。,Sanger反应（2.4一二硝基氟苯，DNFB）氨基酸与DNFB反应生成DNP氨基酸。DNP-氨基酸被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。,3、烃基化反应,（弱减）,（黄色）,西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。,4、生成西佛碱的反应（Schiff）,茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（max=570nm）。,（三）-NH2和-COOH共同参加的反应,1、与茚三酮反应,氨基酸与茚三酮反应,（四）侧链R基参加的反应,Pauly反应：检测酪氨酸。酪氨酸的酚羟基与重氮化合物结合产生桔黄色化合物。组氨酸的咪唑基与重氮苯磺酸形成类似的化合物，呈棕红色。,精氨酸的胍基在硼酸钠缓冲溶液中与1，2环己二酮生成缩合物,半胱氨酸的巯基反应性能很高可发生多种反应，与金属离子形成稳定程度不等的络合物，可导致蛋白质变性。半胱氨酸侧链上的巯基可与碘乙酸生成羧甲基半胱氨酸。巯基不稳定两个半胱氨酸靠近极容易被氧化成二硫键，形成胱氨酸。,Gly（甘氨酸）只有一种构型,无旋光性Thr（苏氨酸）和Ile（异亮氨酸）有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型。,七氨基酸的旋光性和光谱性质,氨基酸的旋光性,L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸组成消旋物,氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的pH值有关。比旋光值是-氨基酸的物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的根据之一。,外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。,胱氨酸有两个不对称中心是相同的，在这种情况下，可以产生L-型和D-型二种异构体；这时一个不对称中心的构型将是另一个不对称中心的镜像（对映体），这样分子内互相抵消而无旋光性，称为内消旋胱氨酸。,内消旋物：分子内消旋,流动相：丁醇、醋酸、水,基本步骤：点样、展层、现色、定性（定量）,（一）基于分配系数（极性）差异的分离方法分配层析,分配系数：在流动相中分配系数越大，移动越快。,固定相：吸附的水,八氨基酸的分离和分析,分配柱层析,支持剂：纤维素、淀粉、硅胶固定相：吸附水流动相；苯酚、正丁醇,离子交换层析是根据氨基酸电荷行为的层析方法。层析柱中的填充物是离子交换树脂，树脂是人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物，具有酸性和碱性基团的颗粒。阳离子交换树脂含有酸性基团（如强酸性树脂含有磺酸基团，-SO3H，弱酸性的含有羧基。-COOH）,可解离出H+，带有正电荷的氨基酸（或蛋白质）和H+交换，结合在树脂上。阴离子交换树脂则相反，强碱型含有-N（CH3)3OH，弱碱型含