实验室指标测定方法.doc

实验常规指标测定及实验仪器的使用采后生理实验室2007年9月3日1、Vc（mg/100g）采用碘量法测定12、可滴定酸（%）参考国标(GB/T 1245690)NaOH滴定法33、可溶性固形物（%）54、呼吸强度（mgCO2Kg-1FWh-1）的测定65、乙烯生成速率（LKg-1h-1）76、氧气生成速率测定87、叶绿素含量测定108、果实硬度（kgcm-2）119、细胞膜相对透性：电导仪法测定1210、乙醇、乙醛含量测定1311、丙二醛（MDA）硫代巴比妥酸比色法1412、多酚氧化酶（PPO）1513、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定1614、过氧化物酶活性(POD)测定1715、多酚类物质1816、总酚含量的测定1917、超氧化物歧化酶（SOD）测定2018、聚半乳糖醛酸梅活性的测定2219、果胶甲酯酶(PE)活性：酸碱滴定法-朱广廉2420、过氧化氢酶(CAT)活性的测定2521、GSH的测定2622、PAL活性测定2723、1氨基环丙烷1羧酸含量(ACC content)的测定：2824、ACC合成酶活性(ACC synthase activity)测定：2925、ACC氧化酶活性(ACC oxidase activity)的测定:3026、游离脯氨酸含量的测定-磺基水杨酸法书180页3127、脂氧合酶活性(OD234/g FWmin):3328、乙醇酸氧化酶活性的测定3429、果胶含量（中国农牧渔业部部标准果胶的测定 NY 82.11-1988）3630、PE3831、PG （植物生理学实验手册-144）3932、纤维素测定方法酸性洗涤法4033、霉变指数4134、带菌率4235、褐变度4336、病害体积（PVD）：4437、果皮颜色的测定4538、显微镜操作4639、色差计使用方法47481、Vc（mg/100g）采用碘量法测定仪器：三角瓶；容量瓶；滴定管；移液管；脱脂棉；漏斗试剂：1%淀粉：取1g可湿性淀粉，先用10ml蒸馏水调匀，然后加90ml蒸馏水煮沸，边煮边搅拌，使其透明为止。1%草酸：取草酸10g，用蒸馏水定容至1000ml备用。0.01 mol/L碘液的配制与标定：配制：取碘化钾（化学纯）3g，置于1000ml容量瓶中，少量蒸馏水溶解后，加入碘（化学纯）2.5g，振荡溶解后用蒸馏水定容至1000ml。（注：用时需适当稀释，以便于读数。）标定：取抗坏血酸（化学纯）0.02g（20mg）置于250ml容量瓶，用1%草酸溶液定容，吸取10ml抗坏血酸标准液，置于100ml三角瓶中，加1%淀粉1ml，再加1%草酸20ml，用标准碘液滴定至蓝色，同时吸取10ml蒸馏水按同样方法做空白滴定，15s不褪色为止。按公式计算碘液的滴定度：H(mg/ml)=(WP/Q)/(V1V2)式中：H每毫升碘液相当于抗坏血酸的毫克数mg/ml;W抗坏血酸的重量mg;P用来滴定得抗坏血酸得毫升数ml;Q抗坏血酸用草酸定容的毫升数ml；V1滴定时消耗碘液的毫升数ml;V2空白滴定时消耗碘液的毫升数ml。方法：称取匀浆15g，移入100ml容量瓶中，用1%草酸定容至刻度，用脱脂棉过滤。吸取10ml滤液，置于100ml三角瓶中，加1%淀粉1ml，再加1%草酸20ml，用标准碘液滴定至蓝色，15s不褪色为止，记下消耗碘液的毫升数。每个样品重复滴定3次，取其平均值，并做空白实验。X=H(V1V2)F100m式中：X每100g样品中Vc的mg数，mg/100g；H碘液的滴定度，mg/mL；V1滴定时消耗碘液的毫升数mL；V2空白滴定时消耗碘液的毫升数mL；F试液的稀释倍数；m试样质量，g。注明：芦笋试验中：称5g匀浆，用草酸定容到50mL，吸取10mL滤液，加淀粉1mL，20mL草酸。黄瓜(油菜、西芹等)：取匀浆20g,用草酸定容到100mL，吸取30mL滤液，加淀粉指示剂1mL，20mL草酸。樱桃：取15g,用草酸定容到100mL，吸取20mL滤液，加淀粉1mL，20mL草酸。葡萄：枣：2、可滴定酸（%）参考国标(GB/T 1245690)NaOH滴定法试剂：0.1mol/L NaOH溶液：称取NaOH 4g，溶于1000ml煮沸并冷却的蒸馏水（用时适当稀释）1% 酚酞指示剂：称取1g酚酞，溶于100ml 95%的乙醇中仪器：碱式滴定管（25 ml）；容量瓶（250 ml）；移液管（20 ml）；三角瓶（100 ml）；漏斗；纱布组织捣碎机；分析天平操作步骤：称取打成匀浆的均匀样品20g，用漏斗转入250 ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，放置30min(摇动2-3次)，混合均匀后，用六层纱布过滤。吸取20ml滤液与三角瓶中，加酚酞指示剂2滴，用0.005mol/LNaOH溶液滴至粉红色，持续1分钟不褪色，记下NaOH溶液用量。每个样品重复滴定3次，取其平均值。结果处理：含酸量X（%）=VNK(25020)100=83.75VNWW式中：X以苹果酸计的总算百分含量（%）；V滴定时消耗NaOH溶液的毫升数；NNaOH溶液浓度(mol/L)；W样品鲜重（g）；K换算系数，取0.067（以苹果酸计）注意：1、有些果蔬容易榨汁，而其汁液含酸量能代表果蔬含酸量，可以榨汁取定量汁液（10ml）稀释后（加蒸馏水20ml），直接用0.1mol氢氧化钠溶液滴定。2、本实验配制溶液用水及稀释定容用水均为去二氧化碳的蒸馏水3、各种有机酸当量值：苹果酸0.067；柠檬酸0.064；酒石酸0.065。因食品中含有多种有机酸,总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。一般分析葡萄及其制品时，用酒石酸表示，其K=0.075；分析柑橘类果实及其制品时，用柠檬酸表示，K=0.064或0.070(带一分子水)，分析苹果，核果类果实及其制品时，用苹果酸表示，K=0.067，分析乳品，肉类，水产品及其制品时，用乳酸表示，K=0.090，分析酒类，调味品时，用乙酸表示，K=0.060。4、0.1mol/L NaOH标准溶液：称取氢氧化钠(AR)120g于250ml烧杯中，加入蒸馏水100ml，振摇使其溶解，冷却后置于聚乙塑料瓶中，密封，放置数日澄清后，取上清液5.6ml加新煮沸过并已冷却的蒸馏水至1000ml，摇匀。标定：精密称取0.6g(准确至0.0001g)在105110干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾,加50ml新煮沸过的冷蒸馏水,振摇使其溶解,加二滴酚酞指示剂,用配制的NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色30秒不褪.同时做空白实验.计算：c =m1000(V1-V2)204.2式中：c氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L；m基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V1标定时所耗用氢氧化钠标准溶液的体积,，mL；V2空白实验中所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL;204.2邻苯二甲酸氢钾的摩尔含量，g/mol。5、原理：食品中的有机弱酸在用标准碱液滴定时，被中和生成盐类。用酚酞作指示剂，当滴定至终点（PH=8.2，指示剂显红色）时，根据耗用标准碱液的体积，可计算出样品中总酸含量。注明：芦笋试验中：取10g匀浆，加50mL蒸馏水，滤纸过滤，取20mL滤液，加入2滴酚酞指示剂，用0.05mol/LnaOH滴定至粉红色。黄瓜(油菜、西芹等)： 樱桃： 取10g匀浆，用蒸馏水定容到100mL的容量瓶，脱脂棉过滤，吸取滤液20mL，加3滴石蕊，每个样品重复3次（NaOH浓度0.05mol/L）葡萄：枣：3、可溶性固形物（%）仪器：洗瓶；大烧杯；脱脂棉；镊子方法：采用pocket refractometer PAL-1测定，每次取4个果，单果重复4次用镊子取汁测定。4、呼吸强度（mgCO2Kg-1FWh-1）的测定方法1：呼吸强度采用GXH-3051型便携式红外线分析测定仪测定；方法2：用气相色谱法测定。取大小一致鸭梨果实9个，分别称重后，分三组置于经空气平衡的8L玻璃真空干燥器中，密闭30min，用10ml注射器从干燥器顶部取出部分气体，再从注射器中取1ml气体，用气相色谱测定，根据制作的CO2标准曲线计算果实呼吸释放出的CO2含量，果实呼吸强度以mL CO2kg-1h-1表示，重复3次。气相色谱（GC7890F，上海天美公司）配置有CO2转化炉、氢火焰检测器( FID)和不锈钢填充柱(Porapak 80-100)，柱长2m，载气N2，进样温度120 oC，柱温60，检测温度360。呼吸强度（ml CO2Kg-1h-1）=测得的CO2含量（玻璃罐体积-果实体积）果实总重量密闭时间5、乙烯生成速率（LKg-1h-1）采用岛津2010型气相色谱仪法测定；每次将5个葡萄果实置于350ml干燥瓶内，密闭4h后取样20ml，用岛津2010气相色谱仪程序升温法测定乙烯含量。采用外标法计算，标样的体积分数为50LL-1色谱柱与条件：Agilent，DB-5（长30m，内径0.25mm，膜厚0.25m）；检测器：FID，温度230；进样口：温度120oC；升温程序：80保持2min，6/min升温至230，保持1min。载气：N2，流速24ml/min；尾吹气：N2，流速30ml/min。尾吹：30ml/min。乙烯的体积分数（LL-1）样品峰面积标样的体积分数标样峰面积乙烯的生成速率（LKg-1h-1）=乙烯的体积分数（玻璃罐体积果实体积）（密封时间样品质量）6、氧气生成速率测定仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴或恒温箱；真空泵。药品： 50nmol/L 磷酸缓冲液pH7.8：取A液（3.12gNaH2PO42H2O配成100ml）8.5ml，B液（7.17gNa2HPO412H2O配成100ml）91.5ml混合后定容至400ml即可； 10mmol/L盐酸羟胺：称取6.9mgNH2OHHCL用磷酸缓冲液pH7.8配成100ml(现用现配)； 17mmolL1对氨基苯磺酸：称取0.2944g对氨基苯磺酸，用30%乙酸微加热溶解后定容成100ml； 100molL1亚硝酸钠：取6.9mg亚硝酸钠用蒸馏水配制成100ml。(1)NO2标准曲线的制作：取7支试管，按表1加入各试剂用量，加完试剂摇匀，10分钟后测A530，以1号试管溶液调零。以NO2浓度能够为横坐标，A530值为纵坐标绘制标准曲线。见表：试管号1234567亚硝酸钠00.10.20.40.60.81.0磷酸缓冲液21.91.81.61.41.21.0对氨基苯磺酸1111111萘胺1111111NO2浓度（nmol/ml）02-5510152025(2)样品测定：NO2-培育：取试材样1g，放入10ml试管中并加入5ml 10mmolL-1盐酸羟胺，真空渗入后，将试管置于30温箱中温育45分钟，以使样品体内产生的O2-与NH2OHHCL充分反应，生成NO2-。显色测定：样品温育结束后，从样品试管中吸取2ml溶液，与1ml对氨基苯磺酸和1ml-萘胺充分混合，约10分钟完成显色反应，显色后的混合液，如有混浊可在2500g条件下离心10分钟，取上清液测A530。以50mmolL-1磷酸缓冲液2ml PH7.7,对氨基苯磺酸1ml,-萘胺1ml混合后调零。(3)结果计算：测得样品A530值后，在标准曲线上查出相应的NO2浓度，然后进行O2计算。O2-产生速率（O2-nmol/mingFw）=O2-产生量NH2OH育温时间（min）样品重（g）=NO2-24V/amingFw式中：4为反应体系毫升数V：为样品提取液总量（ml）a：为测定用样品提取液量（ml）7、叶绿素含量测定（1） 材料：新鲜（或烘干）的植物叶片（2） 仪器设备：分光光度计；研钵2套；剪刀；玻棒；25ml棕色容量瓶3个；小漏斗3个；直径7cm定量滤纸；吸水纸；擦境纸；滴管；电子顶载天平（1/100g感量）。（3） 试剂：95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 （4） 实验步骤：1）取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2）称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml 95%乙醇（或80%丙酮）研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置35min。3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5）把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以96%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。6）、如用95%乙醇计算公式：Ca = 13.95D665 6.88D649Cb = 24.96D649 7.32D665Cxc=（1000D470 2.05Ca 114.8Cb）/ 245如用80%丙酮计算公式：Ca = 12.21D663 2.81D646Cb = 20.13D646 5.03D663Cxc=（1000D470 3.27Ca 104Cb）/ 229式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；CxC为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度，叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm。7）求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用mg/g鲜重或干重表示）：色素的浓度X提取液体积X稀释倍数叶绿体色素含量=-（mg/g）样品鲜重（或干重）注明：芦笋试验中：称1g匀浆，加20mL95%乙醇，滤纸过滤在波长665nm,649nm,470nm下测定吸光值。 樱桃： 葡萄：枣：8、果实硬度（kgcm-2）仪器：去皮器方法：采用英国产TA.XT.Plus物性测定仪测定，每次取4个果在胴部去皮测定，单果重复4次取最大力，最后取其平均值；测试深度为10mm，P/2柱头（2mm），测试速度为2 mm/sec。（1） 双击Texture Exponent 32（2） 关闭Not Regosterel（3） Select a user 点OK（4） 进入TEE32界面，进入过程中，将其他所有窗都关闭（5） 点File选择New，双击Graph，最大化该窗口（6） 点TA（7） 将所测物品在载物台上放好（8） 点Quick Test Run（9） 点Library选Return to Start SeQ（10） 点Up data project（11） 点File选SAVE9、细胞膜相对透性：电导仪法测定用DDS- A型电导仪 上海雷磁仪器厂生产 测定,采用1cm直径的打孔器在5个果实赤道线上,去皮后即刻切取1mm厚薄片15个,置小烧杯中,加30mL去离子水,立即测其电导率P0,10min后测其电导率P1,然后煮沸5min,冷却至室温,并加水至刻度,测其电导率P2膜相对透性=P1-P0/P2-P0100%膜相对透性测定重复3次,取其平均值.硬果率以每次测定时果肉硬度大于3.0Kgcm-2的果实数目占最初总果实数目的百分比表示.。（1）果皮相对电导率：电导仪法测定仪器：小烧杯；三角瓶；洗瓶；纱布；电炉方法：用DDS- 11A型电导仪测定，取大小一致的果皮 20片（做2个重复），蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中，加30mL蒸馏水，在振荡器上30振荡1h后测其电导率P1，然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织，冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min，测其电导率P2，重复3次，取其平均值。膜相对电导率=P1-P0/P2-P0P0空白电导率（蒸馏水的电导率）（2）果肉相对电导率：电导仪法测定仪器：小烧杯；三角瓶；洗瓶；纱布；电炉方法：用DDS- 11A型电导仪测定，取大小一致的果肉 20片（做2个重复），蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中，加30mL蒸馏水，在振荡器上30振荡1h后测其电导率P1，然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织，冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min，测其电导率P2，重复3次，取其平均值。膜相对电导率=P1-P0/P2-P0P0空白电导率10、乙醇、乙醛含量测定取20粒葡萄，去皮去核后打浆后，称取20g 匀浆样品，用200ml蒸馏水转入烧瓶中，用电热套加热蒸馏出100ml混合液。气相色谱条件：(岛津2010型)配置FID检测器和毛细管玻璃柱(DB-WAX )。载气N2，流速14ml/min，进样量为1l。柱温100，气化室温度150 ，检测器温度100。11、丙二醛（MDA）硫代巴比妥酸比色法作者：郝再彬等，植物生理实验哈尔滨工业大学出版社，哈尔滨，2004，9。试剂：0.6%硫代巴比妥酸(TBA):称0.6g硫代巴比妥酸用100ml 10%三氯乙酸溶液定容或用热的蒸馏水溶解后定容(现配现用)。10%三氯乙酸（TCA）：10g TCA用水定容至100ml。方法：称取试样5g，加10ml质量分数为10%三氯乙酸溶液，研磨至匀浆，10000 r/min 下离心20 min；取上清液2ml（对照加3ml 10% TCA溶液），加入2ml 质量分数为0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 溶液，混匀后沸水浴上反应30min，迅速冷却后再离心(如澄清可以不离心)。取上清液测定450、532、600nm波长下的吸光度。计算：按下式计算MDA的含量（%）：c111.71A450c26.45(A532A600)0.56A450 式中：c1可溶性糖的浓度，mmolL-1c2MDA浓度， molL-1 A450、A532、A600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。按下式算出MDA的浓度（molg -1）：MDA质量摩尔浓度（molg -1）cNW-1式中：cMDA的浓度，molL-1；N提取液体积，ml；W植物组织鲜重，g12、多酚氧化酶（PPO）方法一：1)0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液2)0.1mol/L儿茶酚（邻二甲苯）：称取1.101g溶于100ml蒸馏水中酶液提取：5g样品于预冷的研钵中，加入适量0.05mol/L PH6.5的磷酸缓冲液（总用量10ml），冰浴研磨成匀浆，410000g离心20分钟，上清夜即为酶提取液。活性测定：（做两组重复实验）3.9ml 0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液+1ml 0.1mol/L儿茶酚+2ml酶提取液，以煮过失活的酶液为对照。37水浴保温10分钟，立即在420nm下测定吸光度值, 30秒读一次，记录5min内得值。计算：酶活力=AD0.01t酶的比活力(0.01Ag-1FWmin-1)=AD0.01tW式中：A反应时间内吸光度的变化D稀释倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数t反应时间(min)W果肉重(g)方法二：比色法21,22,23酶液提取：取5g果肉，于10ml的0.05mol/l磷酸缓冲液中(pH=6.5)，冰浴研磨，在4下10000r/min进行冷冻离心20min，取上清液进行酶活测定。酶活测定方法：参照Galeazzi（1981）的方法，并加以改进：向试管中加入3.9ml0.05mol/l pH=6.5磷酸缓冲液，加2ml粗酶提取液，对照用煮沸5min的酶液，于37水浴中平衡10min,取出试管向其中1ml 0.1mol/l的儿茶酚，立即计时，记录随后3min 内溶液在420nm处的吸光度变化，每30s读数一次。重复三次。以每分钟变化0.1吸光度值所需酶量为一个酶活单位，用A420nmmin-1g-1FW表示：13、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照薛应龙等人的方法进行，略有改进。定期取果5个，去皮去核，剪碎混匀后取1g 果肉于预冷的研钵中，加入0.1克聚乙烯吡咯烷酮（PVP），加入10ml含5mmol/L巯基乙醇的0.05mmol/L的0.05M硼酸缓冲液（pH8.8），冰浴研磨，10000转/分离心20分钟，上清液用于酶活测定。取上清液1mL酶液，加入2ml的0.1M硼酸缓冲液（pH8.8）,0.02M L-苯丙氨酸1mL，混匀后立即用分光光度计测OD290初始值，38水浴30min后测定终止值。重复三次。14、过氧化物酶活性(POD)测定样品提取与PPO同，测定参照蒋跃明152的方法(1997)。反应体系：2.9mL磷酸缓冲液，1mL愈创木酚和2mL酶液，以煮过失活的酶液为对照，加入酶液后，立即于37水浴中保温10min，取出试管向其中1ml2%的H2O2，于470nm波长下比色，30秒读一次，记录5min内得值。重复三次。酶比活力（0.01A/gFWmin）=A0.01wtD15、多酚类物质1）酒石酸铁溶液的配制：取0.1 g FeSO4.7H2O，含有4个结晶水的酒石酸钾钠0.5g，加蒸馏水溶解定容到100ml。2）酶液提取：取20g 果肉，冰浴研磨，假如PH7.8磷酸缓冲液定容至100ml，沸水浴加热10 min，过滤，冷却至室温，滤液为供试液。3）比色测定：5ml供试液，加5ml磷酸缓冲液，加5ml酒石酸铁溶液，充分摇匀后立即测定OD540nm，空白：蒸馏水5ml多酚%(以茶多酚计)=A7.826V11001000V2m式中：V1-供试液总量V2-供试液吸取量m-样品质量16、总酚含量的测定(1)药品：75甲醇：375ml甲醇125ml水20Na2CO3：20g无水碳酸钠定容至100ml容量瓶中(也可在烧杯中直接加入100ml水融解即可)（放置不会出现沉淀）Folin-Ciocalteu试剂：1体积的F-C2体积的水(2)实验步骤：酶液的提取：取研碎的材料1g于50ml三角瓶中，加入25ml75的甲醇溶液，密封水浴（55）浸提3h，减压过滤（或者离心3000转30分或10000转10分），并用75的甲醇溶液定容至50ml。含量的测定：参考Kequan Zhou等人的方法并略有改进。新制取的Folin-Ciocalteu试剂1ml，加入0.5ml提取液后，再加5ml去离子水，混匀，然后加入3mlNa2CO3溶液（20）。室温下静置2h，在波长765nm处测定吸光度值（严格来说应该先扫描一下最大波长），以焦性没石子酸作标样。（对照用水和自制的差别不大）(3)Folin-Ciocalteu试剂的制备在250ml的磨口回流装置加入10g钨酸钠（），2.5g钼酸钠（），70ml水，再加入85的磷酸5ml及10ml浓盐酸，充分混匀后，以小火回流10h。再加入15g硫酸锂，5ml水及数滴液溴，然后开口继续沸腾15min，以便驱除过量的溴，冷却后定容成100ml，置棕色瓶中，保存在冰箱中（溶液成金黄色，如成绿色弃去）使用时，1体积试剂用2体积的蒸馏水稀释。(4)加入去离子水的作用稀释提取液中的甲醇，因为甲醇与Na2CO3溶液很难溶，所以要加水稀释，如果你的提取液中不含有机试剂（包括甲醇乙醇等）或者含量很少，也可以不加水稀释。17、超氧化物歧化酶（SOD）测定一、试剂1、0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液；2、130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.399gMet，用磷酸缓冲液溶解定容至100ml；3、750mol/L氮蓝四唑(NBT)：称取0.06133g NBT，用磷酸缓冲液溶解并定容至100ml，避光保存；4、20mol/L核黄素溶液：称取核黄素0.0075g，定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍；5、100mol/LEDTANa2：称取0.0186g，定容至500ml。二、仪器：研钵；离心机；移液管；移液枪；日光灯；分光光度计。三、方法1、酶液提取：称取果肉5g于预冷的研钵内，加2ml预冷的pH7.8磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，加入缓冲液冲洗研钵，并使最终体积为10mL。于4下10000转离心15min，上清夜既为SOD粗提液。记下总体积。2、显色反应：取透明度好，质地相同的小三角瓶4个，2个为测定，2个为对照，按下表加入试剂：（当测定样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中试剂按比例混合后一次加入2.90ml, 酶液和核黄素除外，然后依次加入酶液和核黄素，使终浓度不变，其余各步与上相同。）试剂名称用量（ml）终浓度(比色时)0. 05mol/L pH7.8磷酸缓冲液130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液750mol/L氮蓝四唑(NBT)100mol/LEDTANa2液20mol/L核黄素溶液酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.100.53.313 mmol/L75mol/L10mol/L2.0mol/L对照两支管以缓冲液代替混匀后，给1支对照管罩上双成黑色硬质套避光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应2030min(要求照光情况一致，反映温度控制在2535之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。3、活性测定：至反应结束后，用黑布罩上三角瓶，终止反应。以避光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定各管的吸光度。4、计算SOD活性=(A0As)VT/A00.5FWV1式中：SOD活性以每克鲜重酶单位表示；A0照光对照管的光吸收值；As样品管的光吸收值；VT样品液总体积（mL）；V1测定时样品用量（mL）；FW样品鲜重（g）。18、聚半乳糖醛酸酶活性的测定一、 目的及意义果胶酶降解果胶物质，存在于高等植物和微生物中，但除了蜗牛以外，在动物界中没有发现果胶酶存在。果蔬在成熟衰老过程中，由果胶酶所引起的果胶物质降解是导致果蔬软化的主要原因。 果胶酶有三种类型，催化三类不同的反映，这三中美分数雨水解酶和裂合酶类，他们分别使果胶质酶（pectinesterase）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）和果胶裂解酶（pectinlyase）.二、 测定原理聚半乳糖醛酸酶水解果胶生成半乳糖醛酸，此物具有还原性醛基，可以用次亚碘酸法进行定量测定，从而反映酶活性。三、 试剂及标定试剂：1果胶溶液：称1g果胶粉，加热溶解、煮沸、冷却后过滤。调整PH3.5，定容至100ml。0.05N硫代硫酸钠：称取12.41g硫代硫酸钠，溶于冷却的煮沸过的蒸馏水中，定100ml配置一周后标定。标定方法：称0.1g左右的重铬酸钾，在120下烘干至恒重，溶于2030ml蒸馏水中，在加入1.8gkI和2N盐酸溶液15ml，充分混合后，用表面皿盖好放在暗处5分钟，然后用200300ml肿瘤水稀释。用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈浅黄绿色，然后加入3ml淀粉溶液，继续滴顶到蓝色消失而变成三价铬粒子的绿色为止。硫代硫酸钠当量浓度计算：N=W/A*0.049035W重铬酸钾重量（g）A表定时消耗的刘代硫酸钠毫升数；0.049035与1N硫代硫酸钠1ml相当的重铬酸钾的克数。1M碳酸钠溶液：称53g无水碳酸钠定溶至1000ml。0.1N碘碘化钾溶液：称25g碘化钾溶于20ml蒸馏水，另取12.7g碘溶玉碘化钾溶液中，待碘全部溶解后，定溶至1000ml，放于棕色平中储存。2N硫酸：0.5可溶性淀粉溶液：四、 操作步骤：取1果胶溶液10ml，加入5ml酶液和5ml蒸馏水，调整PH3.5，在50水浴中保温2h，取出加热煮沸，冷却后取5ml反应液移入100ml三角瓶中，加1M碳酸纳1mll，0.1N碘碘化钾溶液5ml，摇匀，加塞，在诗文下放置20分钟，加2N硫酸2ml，用0.05N硫代硫酸钠滴定至淡黄色，加0.5碘分指示剂1ml，继续滴定至蓝色消失为止，记录消耗硫代硫酸钠的毫升数（A）。对照试验用1果胶溶液10ml，加10ml蒸馏水而不加酶液，不经保温，直接取5ml此混合液于100ml 三角瓶中用于滴定，记录所消耗的硫代硫酸钠的毫升数（B）在上述条件下，每小时酶促催化果胶分解成1毫升游离的半乳糖醛酸的酶量，定义为一个酶活性单位。计算公式：up=(B-A)N0.5120/525式中：up-每毫升酶液的酶活性单位B-空白消耗硫代硫酸钠溶液毫升数A-试样消耗硫代硫酸钠溶液毫升数20-反映液总体积毫升数5-吸取反映液毫升数2-反映时间5-所加酶液毫升数0.51-1毫克当量碘相当于0。51毫克游离半乳糖醛酸N-硫代硫酸钠当量19、果胶甲酯酶(PE)活性：酸碱滴定法-朱广廉取15g果实，加入1%NaCl 50ml打浆，取匀浆10ml于5000r/min离心10min，再用0.5%NaCl溶液反复提取两次后定容到50ml，此为粗酶液。酶活性的测定：取10ml含0.5%NaCl的1%果胶溶液2份，分别加入2滴中性红溶液，用0.05mol/lNaOH滴定到红色刚刚消失，将溶液置于30恒温水浴中，加入4ml pH7.0的酶液，摇动，立即计时，观察颜色变化，待红色出现时滴加NaOH到红色消失，试验进行1hr记录下消耗的NaOH量，以每ml酶液每min内释放1mmolCHO-为一个酶活性单位。酶液的制备：称番茄果实3个除去非食用部分，切碎打成匀浆待用。取匀浆液25克，加入25 ml1%NaCl溶液搅匀，全部转入离心管中，于5000g离心10min。上清夜移入100 ml容量瓶中，再用20 ml0.5%NaCl溶液提取沉淀两次，提取液并入容量瓶中，用0.5%NaCl溶液定溶到100 ml，此液为粗酶液。取20 ml含0.5%NaCl的1%果胶溶液2份，放入100 ml三角瓶中，加入2滴中性红溶液，用0.05mol/mlLNaCl滴定至红色刚刚消失；将三角瓶放入30恒温水浴中预热3min，加入1 mlpH7.0的酶液，摇动，立即记时，观察颜色变化，待红色出现后，滴加0.05mol/mlNaOH到红色消失，重复此步操作，实验进行30min记录30min内滴加的NaOH量。加入的NaOH摩尔数，就是酶解后释放的游离羧基的摩尔数。计算酶的提取液中果胶甲酯酶的活力：以每ml酶液每min内释放1mmolCH3O-为1个酶活力单位。果胶甲酯酶活性（mmolCH3O-min-1g-1FW）=0.05VV1103V2TW式中：0.05NaOH的摩尔浓度；V样液总体积（ml）；V1消耗的NaOH ml数；V2应系统内加入酶液的体积（ml）；T酶促反应时间（min）；W取样重量（g）20、过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用碘量法106，5g果肉加入50mMpH7.8的磷酸缓冲液5ml和少量的石英砂，冰浴研磨，定容至50mL冷冻下离心20分钟，上清液即为待测酶液。测定时取1 ml酶液加入三角瓶(酶液量可根据酶活性而定)，在20下保温5分钟，然后加入0.1M H2025m1，精确反应5分钟，然后用2m110%硫酸终止反应。加1m12%KI和3滴钼酸铵，再用0.1 MNa2S203进行滴定，滴定至淡黄色时加入1%淀粉5滴，溶液变蓝色，继续滴定至蓝色消失即达滴定终点。对照先用2m110%H2S04杀死酶液，其它步骤同上。最后根据滴定值和空白值计算CAT活性。CAT活性(mgH202g1F Wmin-1 )=被分解的H202(mg)酶液稀释倍数测定时酶液用量样品重(g)时间(min)21、GSH的测定参照Guri(1983) 211法并修改。称取 lg 鲜样，加入3 mL冰预冷的5mmol/L EDTA-5%TCA溶液低温研磨提取。12 000r/min 4下离心10 min，收集上清液立即用于GSH测定。GSH反应体系包括1 mL上清液，1 mL0.2M pH8.0的磷酸缓冲液，2 mLDTNB。反应液于25下恒温水浴20 min后，于412 nm处测定样品吸光度。参比用磷酸缓冲液代替。用标准GSH制作标准曲线。样品重复测3次。GSH含量用g GSH/gFW表示。22、PAL活性测定参照Koukol和Conn (1961)的方法，从10个果实中取出2 g果肉组织，加10 ml提取缓冲液(0.2 mol/L pH8.8的硼酸缓冲液，含0.005 mol/L疏基乙醇，0.001 mol/L EDTA, 0.001 mol/L DTT)及10% PVPP，冰浴中研磨匀浆，于415000g离心20 min，上清液用于酶活性测定。取0.8 ml上清液，加入到3 ml反应体系中(2 ml 0.2 mol/L pH 8.8硼酸缓冲液；1 ml 0.05 mol/L L一苯丙氨酸)，30水浴90 min，然后加入6 N HCl 0.2 ml终止反应(离心除去沉淀)，测定290 nm处吸光值。酶活性用吸光值的变化表示，酶活性单位为:OD/mg pro.hr。重复3次。23、1氨基环丙烷1羧酸含量(ACC content)的测定：取3.5g果肉组织加石英砂充分研磨，呈果浆状。加入7mL 95%乙醇，混匀转移至10 ml离心管内。常温4000r/min离心15 min，上清液为ACC样品。取0.8 ml上清液加入0.1 mlHgCl2后密封，放置于冰水浴上。向密封体系内同时注入67 L 5% NaOCl和33 L饱和NaOH，立即振荡15s 。抽取1 ml顶空气体使用SP6800气相色谱仪检测果实乙烯的释放量。重复3次。结果表示为nl g-1h-1。24、ACC合成酶活性(ACC synthase activity)测定：参照Fan等(1998)方法。从10个果实中取5.0g混合果肉，加入10.0 mL提取缓冲液(400.0 mmol/L的磷酸缓冲液，pH 8.5；1.0 mmol/L的EDTA；0.5% (V/V)的巯基乙醇；10.0 umol/L的磷酸吡哆醛)提取，上清液用于酶活性测定。取0.4mL上清液加入到1.6 ml反应体系(250.0 umol/L的SAM；10.0 umol/L的磷酸吡哆醛；50 mmol/LHepes-KOH，pH8.5)中，32水浴1h，然后加入0.2 mL 50.0 mmol/L的HgCI终止反应，用橡皮塞密封，同时注入200.0 uL 5%的NaOCl和饱和NaOH混合液(V/V=2:1)，立即振荡15 s，取1.0 ml样品气体检测乙烯浓度。重复3次。结果表示为nmolg-1 h-1。25、ACC氧化酶活性(ACC oxidase activity)的测定:参照Barry等(1996)方法。称取3.0g果肉组织，用液氮研磨后，取0.5g样品粉末置于1.5 ml的eppendorf管中，加入1.0 ml提取液(含有Tris-HCl缓冲液100 mmol/L，pH 7.5；10%甘油(V/V )；抗坏血酸钠30mmol/L；5%PVP；FeSO40.1 mmol/L，DTT5.0 mmol/L)，摇匀。在12000r/min(4)下离心两次(时间分别为0.5 min和10min )；将0.2 ml上清液注入盛有1.8 ml酶反应液(含Tris-HCl缓冲液100mmol/L，pH 7.5；10%甘油(V/V )：抗坏血酸钠30 mmol/L； NaHCO330mmo1/L；ACC 1.0 mmol/L；FeSO40.1 mmol/L)的玻璃管中，30水浴密闭保温20 min，抽取1 ml测定乙烯浓度。重复3次。结果表示为nL g-1 h-1。26、游离脯氨酸含量的测定-磺基水杨酸法书180页仪器：具塞试管；移液管；滴管药品：2.5%的茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮放入烧杯，加入60ml冰醋酸和40ml6mol/l磷酸，于70度下加热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中在4度下23日内有效；3%磺基水杨酸溶液茚；脯氨酸；甲苯方法：1）绘制脯氨酸标准曲线：称取10mg脯氨酸溶于少量乙醇中，用蒸馏水定容至100ml，成100gml-1的母液。取母液0.0ml、0.5ml、1.25ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml分别放入7个50ml容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至50ml，配成0.0gml-1、1.0gml-1、2.5gml-1、5.0gml-1、10.0gml-1、15.0gml-1、20.0gml-1的系列溶液。分别取上述各溶液2ml，加入已编号的7个试管中，再分别加入2 ml冰醋酸、2 ml2.5%的茚三酮试剂、2 ml3%磺基水杨酸溶液。摇匀后，在沸水浴中加热显色60分钟，取出冷却至室温，向各试管中加入4 ml甲苯，在振荡器上振荡或手工充分振荡，以萃取红色产物。萃取后经静置，使红色物质全部转移甲苯层。用滴定管或注射器轻轻吸取红色的甲苯溶液于比色杯中，在520nm处测定吸光度值，以脯氨酸含量和吸光度值绘制。2）游离脯氨酸的提取：称取0.10.5g叶片材料，剪碎后放入具塞试管中，加5 ml磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10分钟，过滤液待测，也可直接吸取提取液测定3）游离脯氨酸的测定：取提取液2 ml于具塞试管中，加入2 ml水、2 ml冰醋酸、4 ml2.5%的茚三酮试剂，摇匀后，在沸水浴中加热显色60分钟，取出冷却至室温，加入4 ml甲苯，充分振荡，以萃取红色产物。萃取后经静置，待完全分层后。吸取甲苯层于比色杯中，在520nm处测定吸光度值。计算：脯氨酸含量（gg-1）=CV1WV2或脯氨酸含量（%）=CV1100WV2106式中：C由标准曲线查得脯氨酸微克数，g；V1提取液总体积，mL；V2测定液体积，mL；W样品重，1g=106g。注意事项：茚三酮试剂现配现用仅在24h稳定；茚三酮的用量与脯氨酸含量有关，一般当脯氨酸含量在10.0gml-1以下，显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/mL，才能保证脯氨酸充分显色。脯氨酸和茚三酮试剂在100度下反应时间要严格控制，不已过久，否则会引起沉淀。27、脂氧合酶活性(OD234/g FWmin):参照Surry(1963)的方法。取果肉2.Og，用5m1 pH6.8磷酸缓冲液冰浴研磨匀浆，匀浆液于 0 13000 r/min 离心 30min，取上清液0.5m1加入到3m1反应液(含0.25mmo1/L亚油酸的0.05mo1/L pH6.8磷酸盐缓冲液)中，于20在lcm光径比色杯中反应，234nm 处测定2min 内吸光值变化。以每g鲜重每min内吸光值增加量表示酶活性。28、乙醇酸氧化酶活性的测定仪器：发光光度计（FG-200型）；冷冻离心机；紫外分光光度计药品：0.1molL-1磷酸缓冲液，pH8.0；0.02molL-1磷酸钾缓冲液,pH8.040mmolL-1乙醇酸钾1mmolL-1甘氨酸缓冲液，pH9.01mmolL-1K3Fe(NC)6(用1mmolL-1甘氨酸缓冲液，pH9.0配制)0.6mmolL-1鲁米诺，pH7.0H2O210醋酸方法：1）酶液的制备：晴朗天气上午10时之后，采摘菠菜或烟草叶约30g，用自来水冲洗干净，用纱布吸干多余的水，加蒸馏水3060ml,在05下研磨成匀浆，4层纱布过滤，滤液于200g离心15分钟，弃去沉淀。上清液用10醋酸将pH调至5.4，2000g离心15分钟，除去蛋白质沉淀，上清液即为酶粗提取液。在每100ml酶粗提液中加入14g(NH4)2SO4使其达到0.2饱和度，不停搅动30分钟，2000g离心15分钟，弃去沉淀。每100ml上清液再加入7g(NH4)2SO4使之达到0.3饱和度。再冰箱中静止30分钟后，2000g离心20分钟，弃上清液。沉淀用0.02molL-1磷酸钾缓冲液（pH8.0）溶解，使其体积为粗提液的0.1，放入冰箱中保存备用。2）标曲线准的绘制：取2.8ml30H2O2，用蒸馏水定容至250ml，其浓度为0.1molL-1的母液。最好在751型分光光度计上测定230nm的光密度值，然后根据H2O2的毫摩尔消光系数（0.