分子生物学方法在食品微生物检测中的应用(精).doc

.分子生物学方法在食品微生物检测中的应用刘雨潇 , 刘士敏 , 王民 , 于瑞敏 , 胡冰冰北京军区 疾病控制中心 , 北京 100042摘要 近年来 , 食品安全受到广泛关注 。 及时 、 准确地检测出食品中的病原微生物是食品安全检测的重要内容 , 食品病原微生物的分子生物学检测技术因其特异性和灵敏性而备受瞩目 。 我们主要介绍了基因探针检测法 、 PCR 检测法和基因芯片 检测法的原理 、 开发及其在食品微生物检测中的应用 。 关键词 食品微生物检测 ; 基因探针 ; PCR 技术 ; 基因芯片中图分类号 Q789文献标识码 A 文章编号 1009-0002(200901-0451-04Application of Molecular Biology Methods in Food Microbiological DetectionLIU Yu-Xiao, LIU Shi-Min, WANG Min, YU Rui-Min, HU Bing-BingCenter for Disease Control of Beijing Military Region, Beijing 100042, ChinaAbstract Recently, food safety has got more and more attention. Rapid and accurate detection of pathogenic microor-ganism in food is an important part of food safety detection. Nowadays, molecular biology methods are outstanding because they have the advantages on specificity and sensitivity. In this article we introduced the principle, development and appli-cation in food microbiological detection of three common molecular biology methods, gene probe, PCR and gene chip.Key words food microbiological detection; gene probe; PCR; gene chip综 述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2009.02.041食品安全性要求食品中不应含有可能损害或威胁人体的物 质或因素 , 它关系到人体健康和社会稳定 。 随着世界经济全球 化 、 贸易自由化和食品国际贸易的迅速发展 , 食品安全已成为事 关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题 , 及时 、 安全 、 准 确 地检测出食品中的病原微生物是食品安全检测的重要内容 。 传 统的病原微生物检测方法步骤繁多 、 效率低下 , 且难以检测生长 缓慢或新型的病原微生物 。 因此 , 人们期待更加快速 、 准确的检 测方法 。 近年来 , 基因探针检测法 、 PCR 检测法和基因芯片检测 法等分子生物学方法因其检测的特异性和灵敏性而 备 受 瞩 目 , 成为食品安全监督的有力工具 。1基因探针检测方法基因探针技术又称核酸分子杂交技术 , 该技术发明于 1968年 , 由华盛顿卡内基学院的 Britten 等共同创建 。 它是分子生物学 中 DNA 分析方法的基础 , 也是当今分子生物学技术中应用最为 广泛的一种 。基因探针是带有标记的基因特异片段 。 基因探针检测技术 主要利用碱基配对原理 , 使互补的 2条核酸单链通过退火形成 双链 。 近年来基因探针技术已被广泛应用于食品微生物的检测 中 , 可灵敏 、 快速 、 直接地检测出致病性微生物 , 不受非致病性微 生物的影响 1-3。每一种病原体都有独特的核酸片段 , 通过分离和标记这些 片段就可制备出探针 , 利用带有标记物的已知序列的核酸探针 , 与待测样品进行杂交 , 如样品中含有特定病原体 , 探针将与目的 核酸序列特异结合 , 最后使用特定的方法测定标记物 , 便可确定样品中有无特定病原体 。 基因探针检测技术不仅具有特异性 、 灵 敏度高的优点 , 而且兼备组织化学染色的可见性和定位性 。 核酸 探针技术主要用于食品中致病性病原菌的检测 。目前 , 国内外研究者已开发出多种基因探针用于食品微生 物的检测 。 Moseley 等 以 生 物 素 标 记 的 沙 门 菌 基 因 片 段 作 为 探 针 , 对食品中的沙门菌进行了检测 , 效果良好效果 。 Kerdahi 等 4使用自动化酶连接的非放射性 DNA 探针 , 迅速准确地检测出了 单核细胞增生李斯特菌 。 陈倩等 5使用针对 ESIEC 大肠杆菌 HPI 毒力岛基因设计的 rp-z 探针 , 成功地鉴定出了 ESIEC 大肠杆菌 。此外 , 已有多种商品化的基因探针试剂盒出品 。 美国 GENE-TRAK 公司研制出了脱氧核糖核酸杂交筛选比色法 , 主要利用特异的基因探针对沙门菌 、 李斯特菌和大肠杆菌的 rRNA 进行检 测 6。 检测步骤如下 :首先设计与细菌 rRNA 互补的基因探针 ; 待 检样品经过增菌培养后 , 溶解细菌 , 并加入带有标记的探针进行 液相杂交 ; 如果待检样品中存在靶细菌 rRNA , 荧光 素 标 记 的 检 测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸 (poly dA 末端捕获探针将与目 标 rRNA 序列杂交 ; 此后 , 把包被多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸 (polydT 的固相载体测杆插入杂交溶 液 , 利 用 poly dA 和 poly dT 间的碱基配对将杂交核酸分子捕获于固体载体上 , 并将固相载体 培养于辣根过氧化酶 -抗荧光素接合剂中 , 使探针上的荧光素与 结合剂结合 ; 最后 , 将固相载体置于酶底物 -色原溶液中 , 使辣根 过氧化酶与底物反应 , 并用酸终止反应 , 在 450nm 处测量吸光 度值 , 以确定样品中是否存在靶细菌 。收稿日期 2008-10-20作者简介 刘雨潇 (1980-, 女 , 博士 ,(E-mail 生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGYVol.20No.3May, 2009451生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.20No.3May, 2009法国梅里埃公司研制的 GENE-PROBE 系 统 采 用 杂 交 保 护 分析法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测 6。 其原理如下 :带 有标记物的基因探针与金黄色葡萄球菌的 rRNA 进行杂交 , 形成 有标记的杂种基因 , 在选择性试剂的作用下游离探针的发光标 记物溶解 , 杂种基因的化学发光标记受到保护 , 此后加入检测试 剂 , 化学发光分子被氧化或水化发出强光 , 用发光计量仪可检测 光的强度 , 以确定金黄色葡萄球菌的数量 。基 因 探 针 技 术 是 目 前 分 子 生 物 学 中 应 用 最 广 泛 的 技 术 之 一 , 是定量检测特异 RNA 或基因序列的有 力 工 具 , 可 用 于 检 测 任何特定病原微生物 。 因此 , 该技术被广泛应用于食品微生物检 测中 。 早在 1990年美国环保总署就已经正式使用探针杂交技术 检测饮用水中大肠杆菌总数 。 但是 , 基因探针检测技术仍存在放 射性同位素标记的核酸探针成本高 、 对人体危害性大 、 反应废弃 物难以处理及操作步骤繁琐等问题 , 这极大地限制了其商品化 应用 。 因此 , 完善非放射性标记探针 , 扩增及放大靶序列和探针 的信号 , 发展简单的杂交方式使探针检测方法更加快速 、 简 单 、 低廉 , 是下一步发展的方向 。2PCR 技术聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction , PCR 技术诞生 于 1985年 , 由美国 Cetus 公司和加州大学联合创建 。 PCR 技术利 用变性与复性原理 , 在体外使用 DNA 聚合 酶 , 在 引 物 的 引 导 和 脱氧核糖核苷酸 (dNTP 的参与下将模板在数小时内进行百万倍 扩增 。 该技术可选择性地放大特定的 DNA 序列 , 因此被广泛应 用于生命科学的众多领域 , 在食品致病性微生物检测方面该技 术也发挥着越来越重要的作用 7-10。 常规的食品微生物检测主要 通过增菌 、 分离培养 、 生化实验和血清学鉴定等 4个步骤进 行 , 一般需要 4d 以上的时间才能得到结果 。 此外 , 常规检测方法的 特异性和灵敏度也不够理想 , 这使得食品微生物检测结果具有 一定的滞后性 , 无法快速 、 正确地指导实践生产 。 PCR 技术的出 现 , 为食品卫生检验带来了新的曙光 , 使用该技术可及时 、 准 确 地检测出食品中的病原微生物 。引物的设计及靶序列的选择是决定 PCR 结果的关键因素 , 引物设计不合理会直接影响扩增结果 , 降低检测的灵敏度和特 异性 , 导致假阳性或假阴性结果的出现 。 因此 , 有研究者针对病 原微生物的特定序列设计引物 , 取得了良 好 的 检 测 效 果 。 16S rRNA 全长约 1540bp , 由保守区和可变区组成 , 在长期的进化 过程中 16S rRNA 的突变较少 , 被称为细菌的 “ 化石 ”。 因此 , 可通 过设计 16S rRNA 保守区引物 , 检测细菌存在与否 , 并通过共同 引物之间扩增产物可变序列的分析 , 定量测定各种细菌间的种 系发生学关系 。 23S rRNA 存在于原核生物核糖体大亚基中 , 序 列长度约为 3000bp , 其序列的可变性较大 。 可利用 23S rRNA 可变区序列的差异 , 对相同菌种不同菌株进行分类鉴定 。 16S 23S rRNA 间隔序列长度随细菌的不同而具有明显差异 , 也可利 用 16S23SrRNA 区间序列对细菌进行分类和鉴定 , 但根据 23S rRNA 绘制的系统发育图谱与 16S rRNA 图谱有一定的差别 , 如 何 将 二 者 结 合 起 来 进 行 细 菌 的 分 类 和 鉴 定 将 是 今 后 的 研 究 方 向 。 此外 , 有研究者通过设计多对引物对细菌进行检测 。 Wang 11采用多引物定量 PCR 技术快速检测了食品中的大肠杆菌 O157 H7、 沙门菌和志贺杆菌 。 大肠杆菌 O157H7的检测极限为 102 109CFU /mL , 沙门 菌 的 检 测 极 限 为 103109CFU /mL , 志 贺 杆 菌 的检测极限为 101108CFU /mL 。实时定量 PCR 技术是近年发展起来的新型技术 , 该技术通 过直接测定 PCR 过程中荧光信号的变化 , 利用电脑分析软件对 PCR 过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量 , 从而成 功地实现了 PCR 从定性到定量的飞跃 。 而且 , 使用实时定量 PCR 技术不需要进行凝胶电泳 , 避免了交叉污染 , 使反应具有更强的 特异性和更高的自动化程度 。 RudiK 等 12采用实时定量 PCR 技 术 , 快速地检测出了食品样品中的单核细胞增多性 李 斯 特 菌 。 Berrada 等 13也采用该技术检测出了色拉中的李斯特菌 。直接快速地测定食品样品中的微生物是 PCR 检测的一个主 要目标 , 但样品中的细菌含量往往不足以进行检测 , 因此需要一 个增菌过程来富集靶细菌 , 这极大地延长了检测周期 。 目前 , 有 研究者将 PCR 技术与免疫学技术及标记探针技术结合起来 , 缩 短了增菌过程 , 取得了不错的检测效果 。 免疫磁珠分离技术是利 用磁珠上的抗体可与相应抗原发生特异性结合后形成抗原 -抗 体 -磁珠免疫复合物 , 并在磁场作用下使复合物发生力学移动 , 与其他物质分离 , 达到分离特异性抗原的目的 。 Fu 等 14将实时定 量 PCR 技 术 与 免 疫 磁 珠 技 术 结 合 , 快 速 地 检 测 出 大 肠 杆 菌 O157H7。 Notzon 15等 也 将 定 量 PCR 技 术 与 免 疫 磁 珠 技 术 相 结 合 , 在 1213h 内快速检测出了肉类食品中的沙门菌 , 检测的准 确率为 80%。 酶联免疫吸附分析法是将抗原 、 抗体的免疫反应和 酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术 , 该方法具 有高度的敏感性和特异性 。 Perelle 等 16使用 PCR-ELISA 法对牛 奶和肉中的沙门菌进行了检测 , 结果证明该方法能灵敏特异地 检测出沙门菌 , 检测极限为 5个 /25g , 检测准确率高达 100%。 随着分子生物学技术的不断发展 , 多重 PCR 、 标记 PCR 和不 对称 PCR 等多种不同的 PCR 方法都被应用于食品病原微 生 物 的检测中 , 它们的应用使 PCR 技术拥有了更高的灵敏度和更短 的周期 。 但普通 PCR 技术在检测中会受到模板制备 、 引物质量与 特异性 、 酶的质量及 PCR 循环数等因素的影响 , 实时荧光定量 PCR 技术在检测过程中会受到同异源 DNA 背景 、 寡核苷酸杂交 特异性 、 TaqMan 探针比例 、 SYBR Green 浓度大等因素影响 , 可 造成定量结果出现偏差或导致出现假阳性和假阴性结果 。 因此 , 在实际应用中应尽量保证上述因素的稳定性 , 并设置阳性对照 , 以尽力避免错误结果的出现 。3基因芯片技术基因芯片技术是采用原位合成或显微打印手段 , 将数以万 计的核酸探针固化于支持物表面 , 与标记的样品进行杂交 , 通过 检测杂交信号来实现对样品的快速检测 。 基因芯片技术是基于 芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生的特异性核酸杂 交 。 其主要步骤如下 :将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面 , 微 生物样品经处理后进行核酸提取和核酸扩增 , 再用荧光素对其 进行标记 , 然后与芯片上的寡核苷酸点杂交 , 最后通过扫描仪定 量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生 物 。 基因芯片的基本原理与核酸杂交相似 , 但它将大量按检测要 求设计好的探针固化 , 仅通过一次杂交便可检测出多种靶基因 的相关信息 , 具有高通量 、 多参数同步分析 , 快速全自动分析 , 高 精确度 、 高精密度和高灵敏度分析的特点 , 是目前鉴别有害微生452物的最有效的手段之一 。探针的制备是基因芯片研究中最为关键的因素之一 。 目前 常用的探针有寡核苷酸探针 、 cDNA 探针和基因组 DNA 探针 。 寡 核苷酸探针是根据待测靶基因特点 , 设计多条特异性寡核苷酸 片段 , 固定在芯片的特定位置上 , 与 PCR 扩增 、 标记的靶基因相 应区段杂交 , 根据特定位置上杂交信号的有无来判定待测基因 是否存在 。 cDNA 探针是通过 PCR 扩增 cDNA 文库中的基因 , 点 样 、 固定于芯片上 , 与带有不同荧光的对照样品 cDNA 片段同时 杂交 , 对比不同标记杂交信号变化 , 并据此检测样品基因表达水 平的变化 。 探针设计好后要在其末端连接上 1015bp 的 po1y dT 作为连接分子臂 , 经 5 端氨基修饰后 , 分子臂末端被连上氨 基 , 便可与活化玻片表面上的功能基团发生连接反应而固定在 玻片表面上 。杂交反应是基因芯片检测的重要过程 。 芯片的杂交属于固 相 -液相杂交 , 其过程与常规分子杂交类似 , 先预杂交 , 再加入含 靶基因的杂交液杂交 , 然后洗脱 、 干燥以待检测 。 杂交时可将玻 片上的自由氨基或醛基等活性基团封闭或失活 , 以防标记的样 品靶 DNA 会与玻片上探针外的其他位点发生非特异性结合 , 消 耗靶 DNA 并产生强的背景 。 杂交后芯片需要经过洗涤 , 以去除 所有未杂交的残留物 。 基因芯片的杂交过程受到很多因素影响 , 包括 : 寡核苷酸探针密度的影响 。 寡核苷酸探针密度过低 , 会 降低杂交信号 ; 密度过高 , 由于荧光共振能在相近分子间转 移 , 也会明显降低信号 。 支持介质与杂交序列间的间隔序列长度 的影响 。 研究表明 , 当间隔序列长度为 15个寡核苷酸时杂交信 号显著增强 。 杂交序列长度的影响 。 芯片检测是基于 Waston-Crick 原则 , 完全配对的双链要比存在错配碱基的双链更具热稳 定性 , 产生荧光信号强度要比存在错配碱基的双链强 530倍 。 因此 , 通过比较荧光信号的强度 , 便可以筛选出合适的标记靶分 子 。 一般而言 , 短的杂交序列更容易区分碱基的错配 , 但短的杂 交序列稳定性较差 , 所以在实验中多采用 20bp 的寡核酸酸探 针 。 杂交序列中 GC 含量的影响 。 在基因芯片中 , 序列组成是最 不确定的参数 , 由于 G 、 C 间形 成 3个 氢 键 , 而 A 、 T 间 形 成 2个 氢键 , 因此从理论上讲富含 GC 的区域杂交稳定性较好 , 在设计 检测探针时应重视 GC 含量 , 尽量做到探针的杂交温度一致 。 杂交温度和模板单 、 双链的影响 。 在实验过程中应该注意上述环 节 , 尽量优化芯片的反应条件 , 提高芯片杂交的特异性 , 减 少 荧 光染料造成的高背景 , 降低反应过程中非特异性杂交所造成的 干扰 。近年来 , 许多学者利用基因芯片对常见致病菌进行了分析 检 测 17-18。 Jin 19通 过 设 计 通 用 引 物 扩 增 细 菌 核 糖 体 16S 及 23S rRNA , 并将扩增产物与含有探针的芯片进行杂交 , 从而在 3h 内 快速鉴定出了致病性肠道微生物 。 Chiang 等 20使用通用引物扩增 出了细菌核糖体 16S rRNA , 并将扩增产物与生物素标记的探针 进行杂交 , 结果可在 4h 内快速检测出大肠杆菌 、 沙门菌及葡萄 球菌 , 检测准确率高达 98%。 Wang 等 21也采用该技术在 4h 内快 速检测出了食物中的致病菌 , 准确率为 97.4%。 Kim 等 22采用比 较基因组学技术 , 针对 11种常见的食物源性致病微生物设计出 了新型探针芯片 , 与全基因组芯片相比 , 可更加快速准确地检测 出食品中的微生物 。作为一种新型检测方法 , 基因芯片技术具有大量 、 快 速 、 准 确的特点 , 但在实际应用中该技术还存在一些不足之处 。 首先在 前期工作中 , 需要准确获得大量靶 DNA 的信息 , 工作量巨大 。 其 次 , 芯片的相关技术亟待改进与提高 。 芯片技术本身面临许多问 题如特异性问题 、 假阴性和假阳性问题 、 芯片的产品质量和可靠 性问题等 。 最后 , 基因芯片的制作工艺复杂 , 费用高昂 。 因此 , 在 今后的研究中应创建靶 DNA 数据 , 共享数据资源 , 节省人力 。 此 外 , 要一步简化基因芯片的制作过程 , 增强检测的灵敏度 , 降 低 检测成本 。基因芯片技术是一项迅速崛起的高新技术 , 它是生命科学 与信息科学的有机结合 。 随着研究的不断深入 , 基因芯片技术必 将在食品卫生检测中得到更为广泛的应用 , 为食品科学研究开 辟一个新的发展时代 。4结语随着经济的全球化发展和食品的跨区域 、 跨国际流通 , 对食 品病原菌的检测要求也越来越高 。 从定性和定量两方面出发 , 准 确 、 快速 、 经济的检测方法是食品安全检测的发展方向 。 尽管分 子生物学检测方法具有诸多优点 , 但目前它们大多处于实验室 阶段 , 不能广泛应用于实践 , 仅能作为标准检测方法的参考 。 因 此 , 在今后的工作中应进一步加快研究步伐 , 建立真正实用的食 品病原微生物快速检测方法 。参考文献1De Vos W M. Advances in genomics for microbial food fermenta-tions and safetyJ. Curr Opin Biotechnol, 2001,12(5:493-498. 2Amann R, Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecologyJ. FEMS Microbiol Rev, 2000,24 (5:555-565.3Yamamoto T, Morotomi M, Tanaka R. Species -specific oligonu-cleotide probes for five Bifidobacterium species detected in human intestinal microflorJ. Appl Environ Microbiol, 1992,58(12:4076-4079.4Kerdahi K F, Istafanos P F. Rapid determination of Listeria mono-cytogenes by automated enzyme -linked immunoas -sayand nonra-dioactive DNA probeJ. JAOAC Int, 2000,83(1:86-88.5陈倩 , 程伯琨 . 基因探针检测食品中具有 HPI 毒力岛的 ESIEC 大 肠杆菌 J. 食品科学 , 2000,21(7:35.6王晶 , 王林 , 黄晓容 . 食品安全快速检测技术 M. 北京 :化学工业 出版社 , 2002:120-160.7Bach H J, Tomanova J, Schloter M, et al. Enumeration of total bacteria and bacteria with genes for proteolytic activity in pure cultures and in environmental samples by quantitative PCR mediat-ed amplificationJ. J Microbiol Methods, 2002,49(3:235-245. 8Brunk C F, Li Jinliang, Avaniss-Aghajani E. Analysis of specific bacteria from environmental samples using a quantitative poly-merase chain reactionJ. Curr Issues Mol Biol, 2002,4(1:13-18. 9Malinen E, Kassinen A, Rinttila T, et al. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5nuclease assays and dot-blot hy-bridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantifica-tion of selected faecal bacteriaJ. Microbiology, 2003,149(pt1:269-277.10Ventura M, Zink R. Specific identification and molecular typing刘雨潇等 :分子生物学方法在食品微生物检测中的应用 453生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.20No.3May, 2009analysis of Lactobacillus johnsonii by using PCR -based methods and pulsed-field gel electrophoresisJ. FEMS Microbiol Lett, 2002, 217(2:141-154.11Wang L, Li Y, Mustaphai A. Rapid and simultaneous quantitation of Escherichia coli 0157H7, Salmonella, and Shigella in ground beef by multiplex real -time PCR and immunomagnetic separation J. J Food Prot, 2007,70(6:1366-1372.12Rudi K, Naterstad K, Dromtorp S M, et al. Detection of viable and dead Listeria monocyto-genes on gouda-like cheeses by real-time PCRJ. Lett Appl Microbiol, 2005,40(4:301-306.13Berrada H, Soriano J M, PicY, et al. Quantification of Listeria monocytogenes insalads by real time quantitative PCR J. Int J Food Microbiol, 2006,107(2:202-206.14Fu Z, Rogelj S, Kieft T L. Rapid detection of Escherichia coli O157H7by immunomagnetic separation and real-time PCRJ. Int J Food Microbiol, 2005,99(1:47-57.15Notzon A, Helmuth R, Bauer J. Evaluation of an immunomagnetic separation -real -time PCR assay for the rapid detection of Salmonella in meatJ. J Food Prot, 2006,69(12:2896-901.16Perelle S, Dilasser F, Malorny B, et al. Comparison of PCR-ELISA and light cycler real-time PCR assays for detecting Salmonella spp in milk and meatsamplesJ. Mol Cell Probes, 2004,18(6:409-420. 17Ye R W, Wang T, Bedzyk L, et al. Applications of DNA microar-rays in microbial systemsJ. J Microbiol Methods, 2001,47(3:257-72.18Wang R F, Beggs M L, Robertson L H, et al. Design and evalua-tion of oligonucletide-microarray method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samplesJ. FEMS Microbiol Lett, 2002, 213(2:175-182.19Jin D Z, Wen S Y, Chen S H, et al. Detection and identification of intestinal pathogens in clinical specimens using DNA microar-raysJ. Mol Cells Probe, 2006,20(6:337-347.20Chiang Y C, Yang C Y, Li C, et al. Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. and Vibrio spp. with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridizationJ. Int J Food Microbiol, 2006,107(2:131-137.21Wang X W, Zhang L, Jin L Q, et al. Development and application of an oligonucleotide microarray for the detection of food -borne bacterial pathogensJ. Appl Microbiol Biotechnol, 2007,76(1:225-233.22Kim H J, Park S H, Lee T H, et al. Microarray detection of food-borne pathogens using specific probes prepared by comparative ge-nomicsJ. Biosens Bioelectron, 2008,24(2:238-246.(上接第 435页 20LShujuan, Wang Jun, Yao Jianming, et al. Study on the effect of mutated Bacillus megaterium in two -stage fermentation of vitamin CJ. Plasma Sci Technol, 2003,5(5:2011-2016.21LShujuan, Wang Jun, YLong, et al. Study on the effect of Bacillus megaterium in two-stage fermentation of VcJ. J Graduate School Chinese Acad Sci, 2004,21(1:84-89.22虞龙 , 余曾亮 . 低能离子注入介导 Vc 前体 (KGA产生菌 DNA 的转 导 J. 核技术 , 2004,27(4:264-267.23Makover S. Ne