曲霉CJ22-326壳聚糖酶对壳聚糖的水解作用模式研究.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别食品（农产品、水产品）加工与储藏项目编号Y305119浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:曲霉CJ22-326壳聚糖酶对壳聚糖的水解作用模式研究申 请 者:陈小娥电 话托单位:浙江海洋学院 通信地址:浙江省舟山市定海文化路105号，浙江海洋学院食品科学实验室邮政编码:316004E-mail :申报日期:2005-5-29浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名陈小娥性别女出生日期1968年06月17日最终学位博士获学位年份2004职称助理研究员主要研究领域甲壳素酶学及其它微生物酶、壳聚糖及低聚糖领域,海洋活性物质E-电 人网页 依托单位浙江海洋学院 证件类型身份证证件号码330726680617114申请者是否近三年调入在浙单位工作否调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息项目名称曲霉CJ22-326壳聚糖酶对壳聚糖的水解作用模式研究申报类别一般项目研究属性前瞻性应用基础研究同行评议组别农业科学及生物技术/食品(农产品、水产品)加工与储藏依托基地名称 预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算12.0万元申请经费8.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字)浙江省是海洋大省，有丰富的甲壳素资源，壳寡糖是甲壳素工业高值化研究的重要方向，壳寡糖的生物、生理功效通常要求寡糖链具有特定的长度。壳聚糖酶(chitosanase)是一种专一性水解壳聚糖的水解酶，它能有效地作用于壳聚糖的糖苷键，从而产生聚合度2-10的低聚糖，但是不同微生物来源的壳聚糖酶特性不同。本项目以沿海土壤中筛选得到的曲霉CJ22-326为出发菌株，对壳聚糖水解酶系进行分离纯化；通过内切壳聚糖酶作用于部分乙酰化壳聚糖的水解产物的分离、鉴定，阐明内切壳聚糖酶的水解作用模式，为特定聚合度壳寡糖的工业化生产提供理论依据；阐明该菌株产外切壳聚糖酶是否为外切氨基葡萄糖苷酶，并为其它研究领域提供工具酶；本项目的研究对于促进壳聚糖酶学研究和推动甲壳素、壳聚糖的高值化开发具有重要的学术意义和很高的应用价值。关键词（不超过4个）曲霉；壳聚糖酶；作用模式；壳寡糖同行评议分组说明其他 重点资助方向农业资源产业生物技术研究申请书版本号：97021334 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1陈小娥1968年06月17日女助理研究员博士浙江海洋学院责人102周弘春1964.01.08男教授博士浙江海洋学制备83曲有乐1960.07.12男教授学士浙江海洋学谱解析64方旭波1972.07.15男工程师学士浙江海洋学解产物分离85朱赞清1976.12.16男助教硕士浙江海洋学解产物分析86宋茹1976.09.08女讲师硕士浙江海洋学分离67罗红宇1968.11.12女高级工程师硕士浙江海洋学酵工程5总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数73310001说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第12页个人介绍：陈小娥：博士，2004年7月毕业于江南大学食品科学专业。在浙江海洋学院从事教学和科研工作，担任食品科学与工程专业实验室主任，研究方向是微生物酶技术及应用、功能性食品、水产品加工研究工作。在国内外核心刊物上发表学术论文20余篇，作为主要成员参加了国家自然科学基金“非专一性酶水解壳聚糖机理研究”(No20271023)、江苏省攻关项目“生物法综合利用虾加工下脚料”（项目编号BE2002318）、浙江省“九五”攻关项目“天然海洋酒类产品开发”以及国家”十五”科技攻关项目”中性纤维素酶高产菌株选育及高效后提取技术研究”的部分研究工作，参与完成浙江省、市级科研项目5项。博士论文：曲霉产壳聚糖酶酶学性质及作用机理研究。与本课题相关论文：1.Xiaoe Chen, Wenshui Xia, Xiaobin Yu. Purification and Characterization of two Types of Chitosanase from Aspergillus sp.CJ 22-326. Food Research International,2005，38（3）：315-322,（SCI、ISTP收录）2.陈小娥，夏文水，余晓斌壳聚糖酶高产菌株选育及发酵条件研究食品与发酵工业，2004，30（3）：66-693.陈小娥，夏文水，余晓斌壳聚糖酶高产菌株的筛选及酶解产物定性食品与发酵工业，2004，30（2）：57-614.陈小娥，夏文水，余晓斌曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶的分离纯化和性质研究无锡轻工大学学报，2004，（3）：10-145.陈小娥，夏文水，余晓斌微生物壳聚糖酶研究进展海洋科学，2004，（3）：72-766.陈小娥，夏文水酶技术在水产加工业中的应用食品与发酵工业2002，28（1）60-637.王丽娟，夏文水，陈小娥，高博脂肪酶水解壳聚糖作用的研究。食品工业科技，2004，25（5），51-53 申请经费预算 8.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费文献、资料费0.72专题学术活动费学术会议、学术交流、论文发表费0.73仪器和设备购置费寡糖分离色谱柱、蛋白分离柱、切向流超滤膜包2.24能源材料费壳寡糖、几丁寡糖标样、工具酶等生化试剂;分析检测药品;试验材料、测试、分析;外协分析检测费;水电费4.05计划管理费管理费0.46人员费 0.0注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .曲霉CJ22-326壳聚糖酶对壳聚糖的水解作用模式研究申请书正文1.项目研究意义浙江省是海洋大省，有丰富的甲壳素/壳聚糖资源，但我们的甲壳素企业生产技术水平不高，产品档次低，应用开发力量分散，研究重复，产业化水平低。生产的甲壳素产品主要出路就是作原料出口到发达国家，或者加工成壳聚糖或氨基葡萄糖盐酸盐再出口，附加值低，随国际市场行情变化影响大，严重限制和制约了我省甲壳素工业的发展。这就迫切需要对甲壳素或壳聚糖进行深加工，开发出用途广、价值大的新的衍生物。壳寡糖(Chitooligosaccharides，COSs)就是甲壳素工业中一个技术含量高和附加值高的深加工产品，是一种新型的生物药物原料。壳寡糖（或甲壳低聚糖）是由壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在2-20的可溶于水的氨基糖类化合物，是国际上近年来新兴发展的功能性低聚糖，具有独特的生理活性和优越的功能性质。壳寡糖在食品上可作为保健品和功能性食品添加剂，具有降低胆固醇和促进钙吸收的能力、促进双歧杆菌增殖及强的吸湿保湿性能；在农业上可作为植物调节和生物防治剂，可开发为一种无公害的新型生物农药；在医药上可作为抗癌药物。但是壳寡糖的上述功能与其聚合度有密切关系1-6，如聚合度为2-3的壳寡糖具有非常爽口的甜味和良好的保湿性和耐热性，在人体内很少被消化道吸收，是糖尿病人和肥胖病人理想的功能性甜味剂；聚合度为3-7的壳寡糖可促进钙的吸收；聚合度为3-6的壳寡糖具有抗肿瘤与抗感染作用，而且随聚合度的增大活性增强，是颇具开发前景的海洋药物。因而以甲壳素/壳聚糖为原料制备特定聚合度壳寡糖是甲壳素工业高值化研究的重要方向，尤其是聚合度为3-6的壳寡糖可以开发成为新型的抗肿瘤药物。国内外虽然有甲壳低聚糖的商品，由于制备方法不同，质量参差不齐，大多是宽分子量范围的化合物，因而其功能性也就不明确。目前工业化生产大多采用酸降解法和氧化降解法，酸降解和氧化降解法因反应条件剧烈，选择性差，而使产物杂质多、单糖含量高，质量不稳定，水解结果具有生理活性的聚合度为3-6的寡糖的收率低，而且水解过程中要用大量的酸和氧化剂，对环境污染严重；而酶解法选择性高，酶降解过程工艺简单，条件温和，不产生环境污染，而且可控制水解产物聚合度，避免了低聚糖的破坏，食用安全性好。壳聚糖酶(chitosanase)是一种专一性水解壳聚糖的水解酶，它能有效地作用于壳聚糖的糖苷键，产生聚合度2-10的低聚糖。但是在微生物壳聚糖酶研究过程中发现存在两个问题：一是不同的微生物产生壳聚糖酶特性不同，对壳聚糖的酶解作用模式不同，因而水解壳聚糖产物的聚合度也就不同；二是微生物产壳聚糖酶活力有待提高，且大多以复杂酶系存在。因此，在应用壳聚糖酶工业化生产壳寡糖前，必须首先通过研究阐明微生物产生壳聚糖酶对部分乙酰化壳聚糖的作用方式，因为在酶法制备壳寡糖时，底物是部分乙酰化壳聚糖；其次是阐明壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖时，得到的壳寡糖不仅与壳聚糖的乙酰化度有密切关系，而且与壳聚糖酶本身的性质有关系。如对于只切断GlcN-GlcN糖苷键的壳聚糖酶，壳聚糖的乙酰化度高，可以得到较高聚合度的壳寡糖，而壳聚糖乙酰化度低，则容易得到聚合度较小的寡糖，因为它可以把降解过程中产生的壳寡糖继续降解。从壳聚糖酶法制备高聚合度壳寡糖这一应用角度出发，课题申请人从沿海土壤中筛到了一株曲霉，产酶活力较高（发酵液酶活在3u/ml以上），发现曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶不水解底物壳四糖(G1cN)4，对壳五糖(G1cN)5水解速度远小于对壳六糖(G1cN)6水解速度，这一特点对于水解生产聚合度为3以上的壳寡糖具有很大优势。因此，研究曲霉CJ22-326壳聚糖酶水解部分脱乙酰化度壳聚糖的作用模式，为甲壳低聚糖保健食品及药品的开发提供理论依。这不仅具有重要的学术意义，而且对于提高我国甲壳素工业的技术水平，促进甲壳素衍生物工业的发展，使虾蟹加工废料资源得到充分利用，带动水产养殖业和昆虫养殖业的发展，加快甲壳低聚糖的开发应用都有重要的现实意义。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系研究目标： 沿海土壤中筛选得到的曲霉CJ22-326为出发菌株，对壳聚糖水解酶系进行分离纯化，多种方法结合检测酶液纯度，必须达到99以上纯度； 阐明内切壳聚糖酶作用于部分乙酰化壳聚糖的水解作用模式，为高聚合度的壳寡糖的工业化生产提供理论依据； 阐明该菌株产外切壳聚糖酶是否为外切氨基葡萄糖苷酶，并为其它研究领域提供工具酶； 阐明曲霉CJ22-326所产内切壳聚糖酶的特点以及和其它微生物来源壳聚糖酶不同之处。为今后该酶的氨基酸序列分析、结构分析打下基础；为提高微生物产目的酶提供科学依据，为甲壳素产业高值化提供技术支持。研究工作长期目标： 霉壳聚糖酶基因的克隆、序列特性分析，构建高效表达内切酶基因的酵母基因工程菌； 应用曲霉产内切壳聚糖酶生产特定聚合度的壳寡糖，进行工业化生产和产业化推广； 为以后壳寡糖的结构与功能的关系的研究奠定基础，并提供壳寡糖标准品； 开发出新型海洋药物抗癌壳寡糖新药； 建成一个优秀的创新团队，主攻研究方向是甲壳素酶学、甲壳低聚糖领域，研究水平居国内领先，应用现代生物技术开发功能食品，尤其是功能性寡糖，和寡糖药物。3、项目研究内容，研究方案和进度安排3.1 项目研究内容 壳聚糖水解酶系酶活测定方法的建立，因为一般测酶活是采用测释放的总还原端基。不能区分是内切酶还是外切酶，只有通过粘度下降法和检测酶解液产物才能定性判定，但此方法太麻烦，因此必须建立一种快速、方便、准确酶活测定方法； 粗酶液和纯酶的制备，通过一系列分离纯化步骤对壳聚糖酶系进行分离纯化并进行纯度鉴定； 以部分乙酰化壳聚糖为底物的内切壳聚糖酶水解产物分析； 以部分乙酰化壳聚糖为底物的外切壳聚糖酶水解产物分析； 混合酶系对部分乙酰化壳聚糖的水解产物分析；并使用Monte Carlo 方法对壳聚糖的酶解进行理论模拟。 采用1H-NMR分析水解产物的异头碳构型。3.2 研究方案 壳聚糖水解酶系酶活测定方法的建立：利用Imoto法或DNS法来检测总的还原糖，可以测定总的壳聚糖水解酶系的酶活（E1），用Elson-Morgan法可以特异性地检测游离氨基葡萄糖，即可以检测外切酶活(E2)。通过两者的E1/E2比值大小就可以判定内切酶活的高低。 粗酶液提取和纯化：对发酵上清液中粗酶，80%饱和度硫酸铵沉淀。利用AKTApurifier蛋白质纯化系统，分离纯化各个酶组分，SDS-PAGE电泳和RP-HPLC鉴定蛋白质纯度。 酶解作用模式研究：对于外切酶确定其是否为外切氨基葡萄糖苷酶（GlcNase，分子生物学的有效工具酶）。采用部分乙酰化度壳聚糖为底物，可直接采用HPLC分析酶解初始产物；对于内切酶则从分析水解产物分析等方面着手。 内切酶组分对部分乙酰化壳聚糖的水解产物分析：方法1：酶解产物先通过甲醇分级沉淀，取各分级沉淀产物进行CM-Sephedex-C-25离子交换，对离子交换下来的各组分分别进行电渗析脱盐、冻干，再用ToyopearlHW-40F或Biogel P-2凝胶再分离，再用HPLC分析各组分，若是单一对称峰且保留时间与标样一致则可确定其结构，也可用HPLC-MS分析测定。若对不上标样，还得用GlcNAcase、GlcNase外切单糖酶来酶解拆分并用HPLC跟踪检测不同酶解时间产物，分析单糖组成和连接序列。用13C-NMR进一步确证其结构。可以明确是作用于GlcN-GlcNAc还是作用于GlcNAc-GlcN糖苷键。方法2：酶解产物，调pH 9，去掉沉淀部分后用活性炭柱分离出(G1cN)n,和杂寡糖；再分别用Dowex 50W和CM-Sephedex-C-25离子交换进行分离。对洗脱的各组分采用制备型HPLC（TSK-GEL G2000PW凝胶柱）分离(每一步分离过程均要用电渗析或纳滤脱盐，冻干，便于下一步分离)。(G1cN)n则用HPLC(Shodex NH2柱)检测，用13C-NMR、1H-NMR进一步确证杂寡糖结构。 用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，分析内切壳聚糖酶水解不同脱乙酰化度壳聚糖，不同水解时间的产物分布，以及壳聚糖酶系水解不同时间的产物分析，并使用Monte Carlo方法对壳聚糖酶系的酶解进行理论模拟，可以充分地反映出中间产物的变化问题，3.3 进度安排2006.1-2006.7 壳聚糖酶粗酶液的获得；壳聚糖酶系的分离纯化和鉴定；2006.8-2007.7 部分乙酰化壳聚糖各酶水解产物的分离制备；2007.8-2007.9 制备水解产物的NMR分析；混合酶系酶解产物的MALDI-TOF-MS分析。2007.10-2007.12 项目结题材料上传。4 项目创新之处4.1国外研究现状国外对微生物壳聚糖酶的研究已经进入了分子水平7，但是与几丁质酶和溶菌酶相比，只有少数壳聚糖酶的基因被克隆，仅仅Streptomyces sp.N174、BacilluscirculansMH-K1、Matsuebacter chitosanotabidus3001 3种细菌壳聚糖酶的初级结构和的活性中心被确定，而其它微生物壳聚糖酶在这方面的研究还比较少。B.circulansMH-K1和Streptomycessp.N174的壳聚糖酶3级结构已被测定，两者分子结构有3个显著差别。根据壳聚糖酶的氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶分成不同的家族，壳聚糖酶分属其中的46、75、80和8号。根据酶的底物特异性，即通过对部分乙酰度壳聚糖底物的作用方式的研究表明，壳聚糖酶可分为三个亚类8。亚类I：降解GlcNAc-GlcN和 GlcN-GlcN糖苷键；亚类II：只降解GlcN-GlcN糖苷键；亚类III：降解GlcN-GlcN和GlcN-GlcNAc糖苷键。其中第I类的代表有Penicillium islandicum， Streptomyces sp.N174；第II类的代表为Bacillus sp. No.7-M,Bacillus PI-7S；第III类的代表为Streptomyces griseus HUT6037和Bacillus circulans MH-K1。根据壳聚糖酶的作用方式的不同，壳聚糖酶可以分为两类：内切型和外切型。内切酶是随机切断壳聚糖链，使体系粘度下降，最终产生分子量较小的寡糖。外切酶则是从糖链的非还原性末端逐个切下单糖体残基。文献报道大部分壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶，但也发现少部分微生物如Nocardia orientalis IF0128069，Aspergillus fumigatus KH-9410、Aspergillus oryzae IAM266011，既产内切酶、又产外切酶。曲霉Aspergillus fumigatus KH-94， Aspergillus oryzae IAM2660内切壳聚糖酶不水解底物壳四糖(G1cN)4；而细菌和放线菌来源的内切壳聚糖酶则能水解底物壳四糖(G1cN)4及以上聚合度的壳寡糖，从而其水解脱乙酰化高的壳聚糖终产物以2-3糖为主的壳寡糖混合物。4.2 国内研究现状国内近几年开始了有关微生物来源的壳聚糖酶的研究，主要是侧重于应用方向研究。首先是产壳聚糖酶微生物菌种的筛选，中国科学院微生物所对杀虫真菌球孢白僵菌进行诱变处理，得到发酵液粗酶活为0.2 u/mL-2.32 u/ml12；郑州粮院微生物所从土壤中筛到了一株细菌属假单孢菌Pseudomonas sp. VIIIT3913能产壳聚糖酶，发酵液粗酶活为0.4 u/mL；浙江大学则筛到了一株青霉产壳聚糖酶14，并对酶进行了固定化研究；西南农业大学在曲霉Aspergillus sojae壳聚糖酶活力仅为12.34mu/ml15，形成四种壳聚糖同工酶，水解壳聚糖的产物是壳二糖；课题申请人则从沿海土壤中筛到了一株产壳聚糖酶活比较高的曲霉CJ22-326，发酵液粗酶活可达3 u/ml，具有潜在的工业化应用价值。从水解产物上看曲霉CJ22-326内切壳聚糖更适合于用来生产高聚合度壳寡糖，它具有显著的特点是其内切壳聚糖酶不水解底物壳四糖(G1cN)4，对壳五糖(G1cN)5水解速度远小于对壳六糖(G1cN)6水解速度，这一特点为生产高聚合度的甲壳低聚糖具有很大优势，水解脱乙酰化度高的壳聚糖终产物以3-5为主的壳寡糖混合物。其次是集中在酶法降解部分乙酰化的壳聚糖得到高聚合度的壳寡糖的工艺上，如大连化物所糖工程组主要是酶法结合膜分离来制备不同聚合度寡糖，工艺复杂，目标产物得率低；而不是从不同微生物产壳聚糖酶的特点（如水解作用模式）不一样这一角度出发来控制壳聚糖水解产物的聚合度。4.3 存在问题我国对壳聚糖酶的研究不够深入，只是在筛选产壳聚糖酶微生物方面和酶法制备壳寡糖上做了一些工作，对壳寡糖的结构分析也较少，武汉大学采用酸性蛋白酶制备聚合度36甲壳寡糖，进行TOF-MS分析16，浙江大学对复合纤维素酶制备的壳寡糖组分进行了分析17，而江南大学致力于研究非专一性酶水解壳聚糖的机理研究；而对专一性降解壳聚糖的壳聚糖酶的酶解作用模式和酶解产物壳寡糖的准确分析等理论方面的研究反而是一个空白。从曲霉产壳聚糖酶方面的报道可以看出，曲霉属壳聚糖酶在酶系组成和酶解低聚糖模式上明显不同于其它属微生物壳聚糖酶；而且同样是曲霉属壳聚糖酶，酶解模式也不同。而国内外均还没有关于曲霉壳聚糖酶水解部分乙酰化度壳聚糖的酶解作用模式研究报道，也就是说不能说明曲霉壳聚糖酶作用的糖苷键类型。这一研究之所以空白可归于以下几个原因：曲霉壳聚糖酶一般是复合酶系，纯化较为困难；酶解产物甲壳低聚糖由于其乙酰氨基单元在链上分布的数量和位置的不确定性，分级分离和鉴定难度较大。4.4 本项目创新之处 首次对曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶水解部分乙酰化度壳聚糖的产物进行分析，阐明了曲霉内切壳聚糖酶的作用的糖苷键类型；为特定聚合度的寡糖生产提供理论依据，为海洋新药的开发奠定基础。 通过曲霉CJ22-326混合酶系对不同水解时间部分脱乙酰化壳聚糖水解产物的MALDI-TOF-MS分析，并使用Monte Carlo方法对壳聚糖酶系的酶解进行了理论模拟，可以充分地反映出中间产物的变化问题，更好的控制水解产物的聚合度。 通过酶水解产物分离纯化、鉴定，形成了具有自主知识产权的甲壳低聚糖标样制备方法；尤其是可以提供杂寡糖标样，填补国内外市场空白。5、工作基础与工作条件5.1 工作基础课题申请人所在课题组多年来对壳聚糖被不同酶的水解作用、甲壳低聚糖的功能性质以及在食品等方面的应用进行了一些研究工作，在纤维素酶、甲壳素酶学领域取得了多项研究成果，形成了自己的研究特色和技术创新体系，有很好的工作基础。前期研究工作是：以沿海土壤中自行筛到的一株产壳聚糖酶活力较高的曲霉CJ22-326菌株（发酵液酶活达3u/ml以上），进行了壳聚糖酶学性质、壳聚糖酶解低聚糖（(G1cN)4、(G1cN)5、(G1cN)6）的水解模式的研究，发表相关论文6篇，其中一篇被SCI、ISTP收录。在微生物壳聚糖酶酶学研究过程中发现曲霉属微生物产壳聚糖酶是复合酶系，酶解模式比较特殊，需要进一步的深入研究，如酶系的组成，酶解壳聚糖的作用模式的深入探讨，以及同一曲霉属不同种的微生物壳聚糖酶之间的差异等都需要做进一步的深入研究。5.2 工作条件 现有实验室面积600m2，具有从事甲壳素研究、测试的基本条件，有HPLC、AKTApurifier蛋白纯化系统、BIOFLO10发酵罐、伯乐电泳仪、冷冻离心机、冷冻干燥等一些设备。 专门用于分离和检测的系列高压液相层析柱、一些特种试剂及标准品可购买配备； 关于一些高级和复杂的结构测试，可到周边高校、院所去完成。 本课题组的成员来自生物工程、食品科学、化学，具有学科交叉优势。因此，本研究课题的顺利开展的条件是具备的。6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路 壳聚糖酶的酶系组成和酶水解作用模式研究，在国内外学术期刊和学术交流会议上发表学术论文3-5篇（其中SCI收录2-3篇）； 利用内切壳聚糖酶生产得到聚合度n3的壳寡糖，在国内外学术期刊和学术交流会议上发表学术论文1-2篇。 曲霉CJ22-326菌株种的鉴定，申请专利一项。利用本项目的研究结果，打算通过国家自然科学基金和省部级资助渠道使研究工作继续发展，争取企业横向合作项目。7、参考文献1 Kittur FS; Vishu Kumar AB; Varadaraj MC; Tharanathan RN. Chitooligosaccharides-preparation with the aid of pectinase isozyme from Aspergillus niger and their antibacterial activity. Carbohydr Res 2005,340 (6):1239-12452 Harish Prashanth KV; Tharanathan RN Depolymerized products of chitosan as potent inhibitors of tumor-induced angiogenesis. Biochim Biophys Acta 2005,1722 (1): 22-29. 3 Chen AS; Taguchi T; Okamoto H; Danjo K; Sakai K; Matahira Y; Wang MW; Miwa IPharmacokinetics of chitobiose and chitotriose administered intravenously or orally to rats. Biol Pharm Bull 2005,28 (3), 545-5484 Jeon,Y. J., Shahidi, F., & Kim, S. K. Preparation of chitin and chitosan oligomers and their applications in physiological functional foods. Food Rev. Int.2000, 16(2):159-1765 Jeon Y J, Park P J, Kim S K. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor. Carbohydrate Polymers, 2001, 44:71-766 Suzuki, S. Studies on biological effects of water soluble lower homologous oligosaccharides of chitin and chitosan. Fragrance Journal, 1996, 15:61-687 戴芸,朱旭芬. 微生物壳聚糖酶的研究概况，浙江大学学报（农业与生命科学版），2004，30（2）：229-2368 Fukamizo, T., Ohkawa, T., Ikeda, Y. & Goto, S. Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus. Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1205:183-1889 Nanjo, F., Katsumi, R., & Sakai, K. Purification and characterization of an e