分子生物学第05章核酸的分子操作

5.1限制性内切酶5.2操作和标记核酸的酶5.3分子杂交,5核酸的分子操作,工具酶的种类,核酸酶：用于切割或降解核酸分子。连接酶：用于把核酸分子连接到一起。聚合酶：用于核酸分子的扩增和拷贝。修饰酶：用于给核酸分子添上或减去某些化学基团或核苷酸。,工具酶的来源,这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中纯化出来的，在细胞中它们原本就参与DNA复制、RNA转录、降解外来核酸分子、修复突变的DNA分子和不同DNA分子间重组等一系列重要的生命反应过程。在重组DNA技术中，它们被用来在人工控制的条件下（体外）工作。值得一提的是，绝大多数这类酶促反应是无法用其它方法来替代完成的，这种不可替代性使这些工具酶在重组DNA技术中占据了极其重要的地位。,限制性内切酶的发现,20世纪50年代初有两个实验室在研究噬菌体的宿主范围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主，如E.coli的品系A，转到另一个品系B时，往往不能生长。但如果进行大量的感染，则有个别噬菌体能生存下来。研究表明，噬菌体在非天然宿主品系中不能生存，是因为噬菌体的DNA被降解了，而细菌自身的DNA却不被降解。为了解释这种现象，人们提出了限制修饰酶假说。,限制修饰假说,限制修饰假说认为，细菌细胞中含有两种酶，一种是限制性核酸内切酶，一种是DNA甲基化酶，这两种酶成对出现，二者对DNA分子有相同的识别序列。DNA甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。限制性内切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因此，非甲基化的外来DNA会被限制性内切酶降解。,限制修饰假说图示,有A甲基化酶和A限制酶,有B甲基化酶和B限制酶,完全甲基化和不完全甲基化,一条链上甲基化而另一条链上没有甲基化的称为不完全甲基化（如刚经过半保留复制的DNA分子），两条链都甲基化的称为完全甲基化。DNA甲基化酶可以对非甲基化的及不完全甲基化的识别序列进行甲基化。1968年从大肠杆菌中发现了型限制性内切酶，1970年分离出了型限制性内切酶，从而证实了上述假说。,各种类型限制性内切酶的性质比较,型限制性内切酶的特点,型酶分子量小，为单亚基多体酶（同源二聚体），以Mg2+为辅助因子，只有切割作用，没有修饰作用（有独立的与之相匹配的甲基化酶）。型酶的识别序列一般为46个bp,切割位点在识别序列内或相邻处（s型，shiftedcleavage），见表52。切割位点在识别位点相邻处的例子如Hga，其识别序列和切割位点记为GACGC（5/10），表示切割位点为5GACGCNNNNN33CTGCGNNNNNNNNNN5,表52部分型限制性内切酶及其切割位点,限制性内切酶切割位点的多寡,如果DNA上的核苷酸顺序是随机的，则对于以4个bp为识别序列的型酶来说，平均44（256）个核苷酸就有一个靶序列；而对于以6个bp为识别序列的酶则平均46（4096）个核苷酸就有一个靶序列。,同裂酶和同尾酶,具有相同识别序列的酶称为同裂酶（isoschizomers），切割位点可以相同也可以不同。如Mbo和Sau3A的识别序列和切割位点均为GATC，Xma的识别序列和切割位点为CCCGGG，而具有与其相同识别序列的Sma的切割位点为CCCGGG。识别序列不同，但切出的粘性末端相同的酶称为同尾酶（isocaudamers）。例如BamHGGATCCBglAGATCTBclTGATCASau3AGATC,同尾酶切割后连接的结果,型限制性内切酶所需反应条件,反应温度和时间：37保温适当长的时间，保温时间一般从半小时到数小时，可通过预备实验确定或按文献资料进行。反应体积：一般为几十l。底物DNA：用无DNase的RNase除去可能污染的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各种杂质（如酚、SDS、EDTA等），最后吹干乙醇并溶于适当的缓冲液中。,型限制性内切酶所需反应条件,反应系统：缓冲液应过滤除菌或高压灭菌，根据不同的限制性内切酶选择高、中、低盐浓度。当用两种以上的限制性内切酶切割时，应先用需低盐浓度的酶，再用需高盐浓度的酶。所加酶量要适当。1单位酶的定义：在限定的温度（一般为37）和缓冲液条件下，在20l反应液中，1小时消化1gDNA所需的酶量。,限制性内切酶的命名,第一个大写字母（斜体）为产酶微生物属名的第一个字母，第二、三两个小写字母（斜体）为种名的前两个字母，第四个大写或小写字母（正体）为变种或株系名的第一个字母，最后的罗马数字为序号（从同一种微生物中分离出了几种限制性内切酶时按发现和分离的先后顺序编号）。,流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）Rd株：Hind大肠杆菌（Escherichiacoli）Ry13株：EcoR淀粉液化芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H株：BamH,核酸的凝胶电泳,为了检测酶切后DNA片段的大小，必须进行凝胶电泳分离。往电泳体系中加溴化乙锭或电泳结束后用溴化乙锭染色，就可以在紫外光下看到DNA带，灵敏度可达5ng。RNA电泳也可用溴化乙锭染色，但灵敏度低得多。DNA凝胶电泳常以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶为介质，前者用于较大片段的分离，后者用于较小片段的分离和序列测定。,溴化乙锭结构式,表53凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围,DNA大小与迁移距离的关系,在一定范围内，DNA分子迁移的距离与其核苷酸对（bp）的对数成反比。,DNA分子的状态与迁移速度的关系,在无EB下电泳，cccDNA泳动速度最快，linearDNA次之，ocDNA最慢。随着EB浓度的增加，更多的EB结合到DNA上，cccDNA分子的负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，迁移速率减小。达到游离染料的临界浓度时，不再有超螺旋，cccDNA分子的迁移速率达最小值。继续增加EB，便形成正超螺旋，DNA分子变得更加致密，迁移速率迅速增加。对绝大多数cccDNA分子而言，游离EB的临界浓度介于0.10.5g/ml。由于电荷的中和，以及EB赋予DNA较大的刚性，随着EB浓度的增加，linearDNA和ocDNA的迁移速率也有不同程度的减小。,大分子DNA的电泳分离,在常规琼脂糖凝胶电泳中，有效分离天然DNA分子的大小最大只能到1520kb。更大的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。此时凝胶不能再按分子大小分离DNA，DNA分子像通过弯管一样，以其一端指向电场的一极而通过凝胶，这种迁移模式谓之“爬行”。,脉冲电泳,1983年，Schwartz等提出了脉冲电场凝胶电泳的设计思想，从而找到了解决这一问题的办法。这一方法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。若DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分开。分子越大，转向所需的时间越长，总的迁移距离就越短，从而达到分离的目的。,交变脉冲垂直定向电场电泳,Schwartz和Cantor（1984）最先设计的脉冲电场凝胶电泳装置采用了交变脉冲垂直定向电场和线电极。,non-uniformfield（200V）intheN-Sdirectionuniformfield（85V）intheE-Wdirection,电场倒转凝胶电泳，FIGE,Carle等（1986）设计的装置为利于单个电场的周期性倒转（电场倒转凝胶电泳，field-inversiongelelectrophoresis，FIGE），舍弃了正交排列的两个电场。电场在两个方向上都是均一的，而正向脉冲稍长于反向脉冲，从而导致了DNA沿相当笔直的轨迹运动。应用微处理机增加电泳时脉冲的绝对长度并保持正反象脉冲的比例不变，可以使分辨力达到最大。FIGE可分辨长达2000kb的DNA片段。10.5V/cm，/Xho两个片段，15kb和33.5kb，在正向0.5sec，反向0.25sec分得很开；T5125kb，T4170kb，在正向3sec，反向1sec分得很开。,电场倒转凝胶电泳的分离效果,垂直凝胶脉冲电泳,Gardiner等（1986）使用的是垂直凝胶装置，铂丝电极装在凝胶的两个对边上。DNA先向一组电极移动，电场转换后则向另一组电极移动。这种“之”字形运动的净结果是从加样孔指向凝胶底部的直线。由于凝胶中的所有泳道均处在相同的电场下，所以DNA的条带不会发生水平变形。这种系统的分辨上限大约为9000kb。,钳位均匀电场脉冲电泳,钳位均匀电场电泳（CHEF）中，由多个在水平凝胶的周围沿正方形或六边形排列的电极产生电场，这些电极都被钳制在预定的电位上。正方形排列的电极产生的电场互成90，六边形排列的电极产生的电场虽凝胶的位置和电极极性的不同而互成120或60。结合运用低电场强度（1.3V/cm）、低浓度琼脂糖（0.6%）、延长转换间隔（1小时）和延长电泳时间（130小时）等条件，有可能分离长达5000kb的DNA分子。,钳位均匀电场电泳的电极分布（CHEF）,物理图谱的定义,标明限制性内切酶在DNA分子上的切割位点和切割位点间距离的图谱，称为DNA的物理图谱，又叫限制性图谱。,图51多限制酶消化法制作物理图谱,图52部分消化法制作物理图谱,ADDDB,0.52.21.31.0,32P,5.0kb,4.0,2.7,0.5,DNA聚合酶的性质,测序酶,化学修饰T7DNA聚合酶是将天然T7DNA聚合酶与O2、低浓度的Fe2+一起保温数天，修饰T7DNA聚合酶的N端结构域，使其丧失99%以上的35外切酶活性，而聚合酶活性不受影响，称为测序酶（sequenase）。后来又发展出了基因工程手段产生出一种改进的测序酶（测序酶2.0版），它完全丧失了35外切酶活性。,DNA聚合酶的53聚合酶活性,切口平移标记核酸探针,带有易检测标记的、已知其序列或来源的DNA片段称为探针。探针的用途是通过碱基互补探寻能够与之杂交的未知DNA片段。先用DNase（牛胰）轻微作用于DNA（在Mg2+存在下），在双链DNA上产生一些切口，然后用大肠杆菌DNA聚合酶及4种dNTP（其中1种带有32P标记）进行切口平移标记。此法利用的是该酶的聚合酶活性和53外切酶活性。,图54切口平移法制备32P标记的探针,Klenow片段的产生,用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶，得到C端70%的分子量为76kD的片段，称为Klenow片段。Klenowfragment具有聚合酶活性和35外切酶活性，没有53外切酶活性。53外切酶活性位于全酶N端分子量为36kD的小片段中。现已用基因工程的方法直接生产Klenow片段（Klenow酶）。,随机引物标记法制备探针,先使待标记的双链DNA变性成单链，再与6bp长的随机引物混合物一起退火，加Klenow酶和4种dNTP（其中1种带有32P标记）合成模板的互补链。互补链从引物的3端延伸。,图55采用Klenow酶的随机引物标记法,逆转录酶,已经商品化的逆转录酶有两种：一种是来自禽成髓细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV），称为禽源逆转录酶。它包括两条多肽链，链65kD，链95kD，具有逆转录活性及很强的RNaseH活性（降解DNA:RNA杂交双链中的RNA）。另一种是从一株能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒（mouseleucocytosisvirus,Mo-MLV）逆转录酶基因的大肠杆菌中分离得到的，称为鼠源逆转录酶。它是分子量为84kD的单链蛋白，具有逆转录活性和相对较弱的RNaseH活性。,逆转录酶,由于RNaseH活性对RNA模板有破坏作用，因此禽源逆转录酶制剂中高水平的RNaseH活性往往趋向于抑制cDNA的产量，并限制cDNA合成的长度。然而，与鼠源逆转录酶相比，禽源逆转录酶能更有效地拷贝较复杂的mRNA。,T4DNA聚合酶,T4DNA聚合酶与Klenow酶相似，它们都具有53聚合酶活性及35外切酶活性，而且35外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强。T4DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶强200倍。,T4DNA聚合酶,T4DNA聚合酶用于补平或标记限制酶消化DNA后产生的3凹端，还用于对带有3突出端的DNA分子进行末端标记。（先切3突出端成凹端，再补上。这一从凹端或平端上循环往复地去除和加上3端核苷酸的反应又称为置换反应。）,末端脱氧核苷酸转移酶催化的反应,（同聚物加尾）,末端脱氧核苷酸转移酶是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量（34kD）的碱性蛋白质，由一个26kD的大亚基和一个8kD的小亚基组成。底物是dNTP和具有3羟基的单链DNA或具有3羟基突出末端的双链DNA。此酶简称末端转移酶。它将dNTP加到3末端羟基上，可用来加多聚核苷酸尾。,碱性磷酸酶,催化单链或双链DNA、RNA5端的磷酸基团水解，成为5OH。它也能催化NTP和dNTP5磷酸的水解。,两种碱性磷酸酶,有两种碱性磷酸酶，即来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP在SDS中加热至68可完全失活，而BAP对去垢剂和高温的耐受性更强，不便于反应后除去酶活性。用CIP催化的反应一般在pH9.3进行。,碱性磷酸酶的用途,碱性磷酸酶用于：DNA或RNA5端标记32P时，除去原有的5磷酸；除去载体DNA的5磷酸以防自身连接，而不影响带有5磷酸的外源DNA片段与载体的连接。,T4多核苷酸激酶,T4多核苷酸激酶催化的前向反应（正向反应）是将ATP的磷酸转移到DNA或RNA的5OH上，用于标记5端（用32PATP）。铵离子和磷酸是此反应的抑制剂，所以应该用Tris缓冲液（pH7.48.0）。该酶还可以在高浓度ATP和ADP存在下催化交换反应，使ATP的磷酸与DNA、RNA5端的磷酸基团交换。此反应的首选反应缓冲液是咪唑缓冲液（pH6.4）。此法标记效率较低，不如正向反应常用。,T4多核苷酸激酶催化的反应,大肠杆菌DNA连接酶的特点,大肠杆菌DNA连接酶可催化含互相匹配的5突出端或3突出端的双链DNA之间形成磷酸二酯键，还可催化切口的连接。该反应需要NAD+参与催化，还需要ATP和Mg2+。最初的研究表明，该酶不能催化平端双链DNA间的连接，但随后发现，在聚乙二醇或Ficoll（聚蔗糖）的存在下，该酶能催化平端的连接。大肠杆菌DNA连接酶不能连接RNA。,DNA连接酶催化的反应,T4DNA连接酶的特点,T4DNA连接酶为一分子量为68kD的蛋白，它催化互补粘性末端的连接或切口的连接。它还可以催化平端的连接，连接平头末端所需的酶量为连接粘性末端的1020倍。加入150200mmol/L的NaCl及低浓度的PEG可大大提高平端连接的速率。T4DNA连接酶催化连接反应也需要ATP和Mg2+。37有利于DNA连接酶的活性，但对粘性末端的结合来说温度太高，两者折衷，一般以415下进行连接反应为宜。,T4RNA连接酶,T4RNA连接酶催化单链DNA或RNA与另一单链DNA或RNA连接。,S1核酸酶（米曲霉）,S1核酸酶是单链内切酶，切割单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA及DNA:RNA杂交体对此酶相对不敏感，但如果所用S1核酸酶的酶量非常大，则双链核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在缺口或切口处作用（第二式）。该酶在酸性条件下作用，以Zn2+为活化剂。,Bal31核酸酶,（AlteromonasespejianaBal31）Bal31核酸酶既是单链内切酶，与S1核酸酶有同样的作用，又是双链外切酶，可以从双链DNA的两端有节制地降解双链DNA，产生缩短的双链DNA。后一功能可用于产生不同缺失程度的突变体。,Bal31核酸酶催化的反应,DNase（牛胰）,DNA内切酶，Mg2+存在时可在双链DNA上造成随机切口，Mn2+存在时可在两条链的大致同一位置上切割DNA，产生平端DNA片段，或产生只带有12个核苷酸单链突出的片段。,外切酶（大肠杆菌）,此酶从双链DNA的两个3端逐个切下核苷酸，可作用于平端及3凹端的双链DNA，不作用于单链DNA及带有3突出端的双链DNA。该酶持续作用不强，因此产物一般为一个被切割程度不相上下的DNA分子集群。,分子杂交,用带有标记的已知核酸片段（称为探针）与变性的未知核酸退火配对的过程就是分子杂交。杂交有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。通过分子杂交可以在许多不同核酸片段中寻找或探测出特定的核酸片段。,印迹,分子杂交中的印迹，是将核酸分子从凝胶或细胞中转移到膜上的过程。杂交必须在膜上进行，所以电泳分离的核酸或培养基上的菌落或噬菌斑必须先印迹到膜上。常用的膜有硝酸纤维素膜（nitrocellulosefiltermembrane，NC膜）和尼龙（nylon）膜。NC膜结合能力较强，杂交信号本底较低，缺点是膜质脆易破，高温下结合核酸分子不够牢固。尼龙膜结合能力比NC膜强，柔性好可反复使用，但有时杂交信号本底较高。,分子杂交,Southern印迹Northern印迹斑点印迹和狭线印迹,印迹种类,杂交种类,滤膜杂交原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交组织、细胞空间定位原位杂交,Sothern杂交,Sothernblotting是1975年由Southern建立并以他的名字命名的一种DNA转移方法。其基本方法是先将待测DNA进行琼脂糖凝胶电泳，使DNA按片段大小分开成带，再用NaOH溶液处理电泳后的凝胶，使其中的DNA变性成单链，然后通过毛细作用将单链DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）或尼龙膜上，膜晾干后在80（真空）烘烤2小时，使核酸片段结合得更牢固，再用标记探针去杂交，通过放射自显影或其他显色方法找出杂交带。,Southern印迹,Southern杂交过程,琼脂糖凝胶电泳碱变性中和印迹到膜上80（真空）烘烤2小时预杂交杂交显带尼龙膜可用毛细管转移和电转移，还可以用真空转移装置进行真空转移。在以尼龙膜为固相载体时，采用双链DNA转移到膜上后再碱变性。,Northern印迹,将RNA进行变性和凝胶电泳后，转移到膜上的过程称为Northernblotting。此法的基本原理与Southernblotting相同，只是不能采用碱变性，因为碱会破坏RNA。RNA的分离采用变性凝胶电泳，变性剂为甲醛或乙二醛。提取、纯化和分离RNA容易受到RNase的破坏，RNase耐高温，100煮沸不能灭