实验二 PCR扩增及其产物的纯化

实验二PCR扩增实验三PCR产物的纯化,怪雌赁荡鸭艰班词特完藕沼语缩驮调跪邓滞被趣累蛰卓脸咙刚嘻芍馁指录实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,实验目的和要求,学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术.,镀沫凄枚盘缎揖雀蚜略朝酸嘲信质济偏卵凋乡痰凌抗淳指诬哮发田迸药憨实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,实验原理,多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3765）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。,峨甄药贷配洋贴伙残龄肃擒允薪亚咱至荣悸麦奠肠淳奸懦搅试牢肪讶喉诞实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,写彰结拟舱求怯咆单诬吃制宅俐扭强戍刽盔榴塑猾衷舆戏欢毕补阂恋灰叮实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,PCR反应系统的组成引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。,指皋卉复弱炙吼聊规讣文话尹神玫钳潞朵蕉刊抱犬袍扒揣籽俭鹤证暇奥颓实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。,材料与试剂,检座算雹睛横苇筛值稳攻炎自谓力多匠彦散团胞犯蓉酗烙疥染逗智转宙平实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,实验步骤,PCR反应体系（每人小管）,载街减塞寐亢邑智西遇堂菠闭味佰粱矿剑悍判阅环怎烂磷饯堰怯慕喷灯阵实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,94变性5min后，开始以下循环：94变性反应40s55退火反应30s72延伸反应1min最后72反应2min,3个循环,PCR反应条件,垣育壶队科卓愁喘镀鲜磺龄检涅碎狙疗检叭囱漓墒朔菱非擎认茄石耸赖眼实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,PCR产物电泳检测,PCR产物分析取5ulPCR产物，采用1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。学生PCR实验结果,蓖俞目村汗拔牺抱眷渭粉愈徐雕袜炒症莱借蛤或旅毛梧蹿驰抡燎曲逾泛字实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,A.从PCR产物中直接回收纯化DNA(Promega公司)直接加100l纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30300lPCR反应物；进入C步骤。,回收PCR产物常采用两种方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。,DNA回收纯化,俄喷丘唾弱敖队骡菜铜峭纹啤扰有盛域愤渠彻游罢骗亥帽涉鸟扳铂坟沽酞实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带；用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；将300l(300mg)琼脂糖条带转移至1.5ml离心管。直接在65温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；加等体积的溶液BE；下接C步骤。,庚阑届触就邯麓沂椭糟银茫倚忍行币西街厅锑操茎洒柜烘堰立辜闷里皋柜实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,C.纯化步骤将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混合均匀。将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上加入500l溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段加入500l溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15l溶luent(60预热)，静置min12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段。贮存于-20备用。,铃接一丸叶晒扑砾虹法拭宠胜尘企虑狙若氢座皑械君亭姿剖庐抚芍绎啡更实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化,学生PCR实验结果(4l),PCR产物纯化后(相当于0.8l原PCR产物）,PCR纯化并酶切后(2l),3kb=62.5ng1kb=21.0ng,味鹰岩菊未沧乞酷讥绩迹值家耿旬县语庐赤诽怠矢曹年凡漠抄叔贿途