实验七-唾液钙和磷含量的测定.doc

.实验七 唾液钙和磷含量的测定唾液中钙与磷的测定都是采用分光光度法进行检测的，可结合自己现有的试剂和实验条件选择完成。（一）唾液中钙含量的测定甲基麝香草酚蓝法（MTB）是络合与比色方法相结合的方法，该方法的灵敏度高，操作简便。【目的与要求】通过实验掌握测定唾液中钙浓度的基本原理和方法，了解分光光度法的定量原理。【实验原理】在碱性条件下，甲基麝香草酚蓝与钙形成深蓝色甲基麝香草酚蓝钙的络合物，该络合物在610nm处有最佳吸收，可采用比色法测定，进而算出唾液中的总钙含量。【实验内容】1.收集口腔唾液2.测定唾液中的总钙含量【实验设备和用品】分光光度计，振荡器，试管，移液器，EP管，烧杯，滴管和吸头等。【试剂及其配制】1.显色基础液（A）称取亚硫酸钠2.40g，溶解于70ml双蒸水中，再加乙醇胺20.0ml，加双蒸水至100ml，储于40C冰箱备用。2.MTB试剂（B） 称取甲基麝香草酚蓝0.018g8-羟基喹咛0.36g和聚乙烯吡咯酮0.6g，加入50%三氯醋酸1.0ml、30%乙醇99ml，内含0.1mol/LEDTA-Na2，pH=3.0，置于24冰箱中保存。3.反应夜（C） 将A和B等量混合，静置20后即可使用。此试剂在28冰箱中保存2天。4.钙标准存储液 将碳酸钙放入110恒温干燥箱中干燥过夜，冷却后，准确称取2.5g，加少量双蒸水，再加入浓盐酸5ml，待碳酸钙完全溶解后，用双蒸水定容至1000ml，储存于塑料瓶中备用。5.钙标准应用液 取钙标准储存液10ml，用双蒸水稀释至100ml，使钙标准应用液浓度为2.5mmol/L。方法和步骤1.标本收集及处理 收集非刺激性唾液约0.5ml，取0.2ml加10%三氯醋酸3.8ml，充分混匀，放置10分钟，3000r/min离心10分钟，取上清液备测。2.测定 准备三组EP管，按表7-4顺序分别加入试剂：表7-4 唾液中钙含量测定试剂（ml）测定管标准管空白管待测唾液样本0.05钙标准应用液0.05蒸馏水0.05反应液3.03.03.0各管在振荡器上混匀，以空白管校正零点，在分光光度计上测定612nm波上下的OD值，按下式计算含量：样品中钙的浓度（mmol/L）=样品管光密度/标准管光密度2.5注意事项1.为保证测试结果的可靠性，所有实验器皿一定要清洗干净且用三蒸水多次冲洗、烤干后待用。也可在试剂中加入少量的EDTA作掩蔽剂，消除实验器皿和试剂中的钙污染，在试剂中加入8-羟基喹咛以去除镁的干扰。2.为避免玻璃中的钙离子溶出，钙标准贮存液用塑料瓶保存。3.为提高分析结果的准确度，减少偶然误差，应增加平行测定次数。4.本实验所测结果为唾液中总钙浓度。思考题1.试分析唾液中钙含量检测误差产生的原因？2.唾液中钙含量计算的方法有哪些第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养实验十 成骨细胞的分离培养实验目的与要求掌握分离、培养和鉴定成骨细胞方法，了解成骨细胞的功能与特性。实验原理骨是机体中代谢非常活跃的组织，一生都在不断的更新与改建。在需要改建的部位，破骨细胞不断吸收骨基质；而在其相对的一侧，成骨细胞不断分泌新的骨基质，并不断钙化。在生理状态下，成骨细胞（osteoblast）的一个显著特征就是可形成矿化结节，因此本实验采用Alizarin Red染色法，能过对形成的矿化结节进行染色等来鉴定成骨细胞。实验内容1.成骨细胞的收集。2.成骨细胞的培养。3.成骨细胞的鉴定。材料、用品与设备超净工作台，倒置相差显微镜，CO2培养箱，消毒的手术剪、刀及眼科手术镊等。试剂及其配制1.-MEM培养基。2.0.5%茜素红 用pH7.2的1%Tris-HCL配制。3.碱性磷酸酶（ALP）染色用孵育液 取2%巴比妥钠5ml、3%-甘油磷酸钠5ml、2%酸钙及2%硫酸镁5ml分别加入量筒，再加入蒸馏水25ml后搅拌溶解。实验方法1.成骨细胞的收集（1）取出生10天内的大耳白兔，乙醚麻醉后，清洗，用75%酒精浸泡消毒5分钟，取出，置超净工作台内，擦干残余酒精，无菌条件下剪开皮肤后环形剪下颅骨（