基因克隆载体PPT课件

.,1,基因克隆载体的特点,具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染色体整合在一起在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制外源基因能在受体细胞中表达克隆载体进入细胞后有可供选择标记,.,2,克隆载体的分类,质粒载体大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体噬菌体质粒载体双链DNA噬菌体载体：单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7病毒载体植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒）动物病毒载体SV40（猿猴空泡病毒）,2.1按构建克隆载体DNA的来源分类,.,3,质粒和噬菌体DNA兼有的载体Phasmid载体（含有f1噬菌体的ori）Cosmid载体（含有DNA的Cos区）染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmidvector）基因整合平台系统克隆载体其它克隆载体,.,4,2.2按克隆载体的用途分类,cDNA克隆载体：gt11，pT7T3原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3原核基因融合（Prokaryoticgenefusion）载体：pGEX-2T，pGEX-3X真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV转录（Transcription）载体：pSL1190普通载体（Generalvector）：pBR322，pUC18,.,5,第二节质粒克隆载体,质粒载体的一般特性,质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入。,.,6,质粒载体的一般特性,质粒的组成与构型细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子细胞外：超螺旋、开环，线形,.,7,质粒DNA分子的大小：细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1kb，大的可达数百kb.不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的宿主细胞中复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列,.,8,6）相关基因,A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，TcrF）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等H)致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒,.,9,几种常见的质粒载体,）pBR322：含有双抗基因（Apr，Tcr）ColE1复制起始子,.,10,2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在LacZ区组装了MCS,.,11,pUC18-19多克隆位点,.,12,3）pBluescriptM13：含有M13噬菌体DNA复制起点的载体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC质粒的载体当中,.,13,pBluescriptM13多克隆位点,.,14,4）Ti质粒载体,.,15,.,16,病毒区基因及功能,.,17,Ti质粒T-DNA的边界序列,.,18,质粒载体的构建,1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行松弛型复制.*选择松弛型质粒复制起始子(Ori)2)构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS)*构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr)*构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片段较大.,3.1质粒构建的基本要求,.,19,3.2pBR322质粒载体的构建,.,20,.3pUC18-19质粒载体的构建,以pBR322为出发质粒，用含乳糖操纵子O、P和Z的DNA片段取代pBR322上的Tcr基因，并在Z区组入一个多克隆位点,.,21,pUC18-19的构建,.,22,3.蓝藻质粒载体的构建,蓝藻作为受体细胞的特点a）原核生物，能进行光合作用，具有固氮能力b）基因组简单，50%的蓝藻含有质粒c）细胞大（10-10于E.coli）储藏蛋白多，单一蛋白可达25%，而大肠杆菌仅为5%d）蛋白更新慢，容受性比较大e）蛋白酶的降解作用比较低，产物比较均一蓝藻质粒的特点a）双向载体（需要两种Ori）b）合适的选择标记c）分子大小合适d）拷贝高,.,23,蓝藻质粒载体pAQE17的构建,.,24,3.农杆菌Ti质粒载体的构建,设计原理:保留T-DNA两侧的边界序列,插入选择性标记,除去致瘤基因和无关基因.共整合质粒载体:将T-DNA区段编码致瘤基因和冠瘿碱合成酶的基因由pBR322上的一段DNA片段取代,当携带目的基因片段的pBR322衍生中间载体进入农杆菌细胞后,两者相同的pBR322序列之间发生同源交换,导致外源目的基因片段整合到Ti质粒上.,.,25,外源片段共整合到Ti质粒上的过程,.,26,双向载体：由两个以上的质粒构建而成.将Ti质粒的Vir与广宿主范围质粒的携带目的基因(MCS)、选择性标记、转移和复制功能整合在一起.双向载体可在大肠杆菌和农杆菌中进行复制并稳定存在下去,双向Ti质粒载体的构建,.,27,第三节噬菌体衍生的克隆载体,.1噬菌体的一般特性噬菌体的组成结构：外壳蛋白DNA形态：头部尾部,噬菌体克隆载体,.,28,噬菌体的电子显微镜照片,.,29,a)在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)在两端各有12个碱基组成的5单链互补粘性末端(Cohesiveend),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)5-GGGCGGCGACCTXXXXG-3XXXXCCCCGCCGCTGGA-5b)基因组DNA上有多种限制酶识别位点c)噬菌体包装DNA的大小为原DNA长度的75-105%(38-54kb),基因组DNA的特点,.,30,1.2基因组DNA的结构,.,31,噬菌体的组装,.,32,1.3噬菌体载体构建的策略,a)去除部分限制酶识别位点b)去除非必需区DNAc)插入可供选择的标记基因,.,33,常用的噬菌体衍生载体,载体名称分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.83021.4Charon4A4.54020.1Charon174.640-22.4Charon2040.36021.37Charon21A41.7021.08Charon2839.39020.05Charon3046.760-20.24LA7140.6024.1Sep6-lac544.3022.4BF10146.06.324.4,.,34,2.Cosmid克隆载体,2.1Cosmid载体的特点a)兼有噬菌体和质粒载体的特点含有噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和细菌质粒载体的复制子(选择标记,可在细菌中保存和大量复制)b)可插入大片段外源DNA,.,35,2.2部分Cosmid载体,Cosmid载体复制子分子量(kb)选择标记克隆位点克隆能力(kb)C2XBpMB16.8Apr,KmrBamHI,ClaI,EcoRI32-45HindIII,PstI,SmaIpHC79pMB16.4Apr,TcrEcoRI,HindIII,SalI29-46BamHI,PstI,CalIpHS262ColE12.8KmrBamHI,EcoRI,HincII3446pJC74ColE115.8AprEcoRI,BamHI,SalI2137pJB8ColE15.4AprBamHI,HindIII,SalI3147MUA-3pMBI4.8TcrPstI,EcoRI,BalI32-48pTL5pMBI5.6TcrBgalI,BalI,HpaI3147pMF7pMBI5.4AprEcoRI,SalI3248,.,36,3.M13衍生的克隆载体,3.1M13噬菌体的特点*环状单链DNA(6407碱基),可转导E.coli*含有基因间隔区(IS-Intersequence)*具有转染作用(E.coli),.,37,3.2M13DNA的复制与M13噬菌体的增殖,a)M13噬菌体吸附在大肠杆菌表面F性毛上,M13ss-DNA(+链)进入细胞b)在宿主细胞内以+链为模板合成大量的-DNA链,成为双链复制型DNA(RF-DNA),同时在宿主细胞内合成大量的特异性蛋白与+链DNA结合c)RF-DNA以-DNA为模板不断合成+链DNA,与特异性蛋白结合,组装成新的噬菌体颗粒.释放到细胞外,而不破坏宿主细胞,.,38,3.3M13衍生的克隆载体,.,39,第四节植物病毒载体,1.花椰菜花斑病病毒（CauliflowerMosaicVirus,CaMV)环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物,.,40,1）CaMV-DNA的一般特性,环状双链DNA（8031bp），在病毒颗粒中以开环的形式存在，分别在-链上有一个缺口(1），+链上有两个缺口（2，3），在缺口中形成三链结构,.,41,花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构,缺口1：GAATTTTTTAA53GCATTTTTTAA55CGCTTAAAAAATT3缺口2：5GGTTGATTACTCGAGCC5GGTTGATTACTCGAGAA33CCAACTAATGAGCTCGGTT5缺口3：5TCCAATAGTCTTCTTTTTCAG5TCCAATAGTCTTCTTTTTGAA33AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT5,.,42,CaMVDNA分子上有八个开放阅读框（ORF)和三个间隔区ORFI：编码运动蛋白，负责CaMV在细胞间运转ORFII：表达产物与蚜虫口针或前肠的特殊位点相结合，参与蚜虫的感染ORFIII：编码病毒结构蛋白ORFIV：编码反转录酶,2)CaMV基因区,.,43,病毒增殖,缺口闭合,侵染,编码病毒反转录酶，35S反转录,表现症状和宿主范围,编码外壳蛋白,花椰菜花斑病病毒基因组DNA的结构,.,44,3)CaMVDNA的间隔区,IR1：位于ORFVI和ORFVII之间，长度为700bp，含有启动转录35SRNA的启动子IR2：位于ORFVII和ORFI之间，长度为60bpIR3：位于ORFV和ORFVI之间，长度为60bp，含有启动19SRNA转录的启动子,.,45,CaMV35S启动子序列,.,46,4）CaMV-DNA限制性内切酶识别位点,在CaMV-DNA的非必需区（II区和VII区）含有限制酶识别位点（如BstEII和XhoI），这些单酶切位点可用于插入外源DNA片段,.,47,CaMV（CabbB-S）DNA的部分酶切位点,.,48,5）CaMV-DNA的存在状态与感染能力,DNA状态伤口感染CaMV+CaMV-DNA+CaMV-DNA-单酶切+CaMV-DNA-双酶切5%CaMV-DNA-双酶切-插入DNA-CaMV-DNA+克隆载体-,.,49,6）CaMV的转录复制与CaMV的增殖,.,50,7)CaMV-DNA克隆载体的构建,基本策略和要求*利用病毒对宿主细胞感染的特性*利用DNA分子上的单酶切位点*替换非必需区*高拷贝地存在于植物细胞中,.,51,互补载体系统,由缺陷型CaMV-DNA分子(携带外源目的基因)+辅助CaMV-DNA分子(携带缺陷型感染所需的基因)共同感染进入植物细胞并表达缺点:突变体之间发生重组,重新产生野生型CaMV,.,52,混合载体系统,将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体同时具有CaMV和Ti载体的特性.通过根癌农杆菌转移到植物细胞中.特点:*扩大了CaMV的正常宿主范围*避免了CaMV突变体之间的基因重组,.,53,2.烟草花叶病毒（TMV)克隆载体,烟草花叶病毒为短杆状，基因组为单链RNA，长为6395个碱基，包括四个阅读框ORF1：编码126kD蛋白质，参与病毒复制ORF2：编码183kD蛋白质，参与病毒复制ORF3：编码移动蛋白（MP)，分子量（30kD）ORF4：编码病毒外壳蛋白（CP,17.5kD）,.,54,TMV的结构特征,.,55,TMV克隆载体构建的策略,.,56,第五节动物病毒基因克隆载体,1.猿猴空泡病毒40（Simianvirus40，SV40),.,57,1)SV40DNA的一般特性SV40DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome）SV40DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录,.,58,SV40基因转录图,.,59,SV40DNA单识别位点限制性内切酶位点,限制性内切酶识别位点KpnI294NaeI343HpaII346HaeII832EcoRI1782BamHI2533BstXI2759TaqI4739BglI5235,.,60,2）SV40-DNA的转录、复制与增殖,SV40感染并进入细胞病毒DNA进入细胞核进行早期转录，合成T抗原启动病毒DNA复制晚期转录，合成包装蛋白组装成病毒颗粒，细胞裂解,.,61,3）SV40DNA衍生的克隆载体的构建,构建SV40DNA衍生克隆载体的策略a)保留完整的T-抗原基因.b)保留复制起始点(Ori),间隔区和终止序列c)替换晚期转录区基因.,.,62,SV40DNA晚期转录区取代型载体,.,63,SVGT5-RG-SV40病毒晚期区段取代载体,.,64,重组病毒质粒载体,含有完整早期区段和复制起始点的病毒质粒载体,.,65,2.腺病毒克隆载体,腺病毒（adenovirus）是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链DNA分子在每一条单链DNA的5端共价结合一种特殊结合蛋白（5.5kD），当DNA从病毒颗粒中释放后，通过该蛋白连接成环状,.,66,腺病毒结构,.,67,腺病毒DNA的结构,.,68,腺病毒克隆载体的构建,.,69,第五节反转录病毒衍生的克隆载体,反转录病毒（retrovirus)是一类含RNA的病毒感染到动物细胞后，病毒RNA通过反转录产生双链DNA分子，可整合到宿主细胞染色体上或成为原病毒，随染色体DNA进行复制、转录和翻译,.,70,1.劳斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV),1）RSV基因组的特点基因组由四条RNA分子构成，两条38SRNA编码病毒的全部遗传信息，两条较小的RNA分子为宿主细胞的tRNATrp38SRNA链带有两段相同的r序列的非编码区，分别位于5-末端和3-末端.,.,71,RSV病毒RNA分子结构,.,72,2）RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译,.,73,3)反转录病毒克隆载体构建策略,a）从感病细胞中分离原病毒DNA.b）根据不同需要引入选择标记、外源基因及DNA复制的启动子.c）与质粒载体重组构建反转录病毒克隆载体d）转化受体细胞E.Colie）包装成新的反转录病毒颗粒.f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基因导入动物细胞.,.,74,第六节基因定位整合克隆载体,为了保证外源DNA在细胞中稳定遗传并不对宿主细胞的代谢产生较大的影响，建立基因整合平台系统，使外源基因定位整合到染色体特定的位点它包括整合平台和整合克隆载体两部分整合平台：受体细胞基因组上给定的DNA区域整合克隆载体：含有一个或两个与整合平台区核苷酸序列同源的DNA片断,.,75,外源DNA整合到染色体上,.,76,1.定位整合克隆载体的种类,1)内源平台双交换置换克隆载体,.,77,2)外源平台双交换置换克隆载体,.,78,3)内源平台双交换插入克隆载体,.,79,4)内源平台单交换插入克隆载体,.,80,2.整合克隆载体的整合效率,基因定位整合的效率与受体细胞的种属和同源DNA片断的长短有关鼠胚胎干细胞hprt基因整合平台系统定位整合效率,.,81,3.定位整合克隆载体的应用,蓝藻染色体定位整合克隆载体酵母染色体定位整合克隆载体植物染色体定位整合克隆载体动物染色体定位整合克隆载体,.,82,第七节酵母人工染色体（YAC）克隆载体,人工酵母染色体（YeastArtificialChromosome）a）保持染色体稳定所必需的顺式作用因子被确定b）建立了酵母高效表达系统c）建立了大片段DNA分离的方法（脉冲场凝胶电泳）目的：用于克隆大于100kb的基因组DNA某些基因如人凝血因子VII基因长达180kb，肌营养不良基因大于1800kb,.,83,1.pYAC4人工染色体,.,84,2YAC克隆载体的应用,1）构建基因组文库或克隆外源基因利用YAC构建基因组文库或克隆外源基因的过程类似于原核生物基因组文库的构建和DNA的克隆过程，通过酶