生物化学课件(第二部分：4-5章)

生物化学课件(第二部分：4-5章),Protein,第章蛋白质的共价结构,蛋白质（Protein）,1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而来第一重要，首要的物质,蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。,一、蛋白质通论,（一）、蛋白质的化学组成和分类,、元素组成,、蛋白质的含氮量,蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16%蛋白质含量=每克样品中含氮的克数6.25凯氏定氮法,、蛋白质的分类,（1）、依据外形分类球状蛋白质：globularprotein纤维状蛋白质：fibrousprotein膜蛋白质：membraneprotein,（2）、依据蛋白质的组成分类,简单蛋白simpleprotein单纯蛋白，仅由氨基酸组成结合蛋白conjugatedprotein,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,简单蛋白,清蛋白和球蛋白albuminandglobulin广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白,结合蛋白,色蛋白：简单蛋白+色素物质糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸,（二）、蛋白质的大小与分子量,蛋白质是分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。,蛋白质与多肽无严格的界线通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,蛋白质月示胨多肽肽AA1*1045*1032*1031000200100-500,（三）蛋白质构象和结构的组织层次,蛋白质的结构层次,一级结构,二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构,高级结构空间构象,示例,（四）、蛋白质功能的多样性,1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能,二、肽（peptide）,AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。,由两个AA组成的肽称为二肽。由多个AA组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。,多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离-氨基的一端：氨基端或N-端含游离-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,（一）、肽和肽键的结构,肽键中C-N键有部分双键性质不能自由旋转组成肽键原子处于同一平面（肽平面）键长及键角一定大多数情况以反式结构存在,共价主链,（二）、肽的物理化学性质,肽末端-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端-氨基pKa值比游离AA中的小。等电点（两性）。酸碱性质取决于：-羧基、-氨基、侧链基团的解离具有双缩脲反应Pr特有的反应。,（三）、天然存在的重要多肽,三、蛋白质一级结构的测定,什么是Pr的一级结构？,蛋白质中氨基酸的排列顺序。,1.样品必需纯（97%以上）2.知道蛋白质的分子量3.知道蛋白质由几个亚基组成4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量,前提,（一）、蛋白质测序策略,(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(2)多肽链的拆分,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(3)断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,蛋白质一级结构的测定,(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比,（一）、蛋白质测序策略,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。,蛋白质一级结构的测定,（一）、蛋白质测序策略,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序,蛋白质一级结构的测定,(8)确定肽段在多肽链中的次序利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。,（一）、蛋白质测序策略,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,两类多肽链末端氨基酸残基：N-端氨基酸C-端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,（二）、末端氨基酸残基测定,Sanger法,1、末端分析,二硝基氟苯（DNFB）法,O,2,N,F,N,O,2,+,H,2,N,C,H,C,R,O,H,N,C,H,C,R,O,O,2,N,N,O,2,H,+,H,2,O,O,2,N,N,O,2,H,N,C,H,C,R,O,O,H,+,氨基酸,DNFB,N-端氨基酸,DNP衍生物,DNP-氨基酸,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,N,碱性条件,二硝基苯衍生物,黄色,二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高,丹磺酰氯（DNS）法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,1N,(DNS-aa),苯异硫氰酸酯（PITC)法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,1N,pH8.3,无水HF,苯异硫氰酸酯PITC,肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线蛋白质N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。,氨肽酶法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,1N,肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质,肼解法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,2C,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,2C,C末端AA氨基醇,还原法,硼氢化锂,肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量蛋白质C-末端残基顺序。四种羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键,羧肽酶法,（二）、末端氨基酸残基的鉴定,、末端分析,2C,（三）、二硫键的断裂,盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,1、酸水解,（四）、氨基酸组成的分析,2、碱水解,1、酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,R1=Lys（K）和Arg（R）专一性较强，水解速度快R2=Pro（抑制）,肽链,水解位点,胰蛋白酶trypsin,R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9,肽链,水解位点,糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）,水解速度与相邻AA性质有关:酸性：-/碱性：+,R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快,肽链,水解位点,R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解,嗜热菌蛋白酶（thermolysin),R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快R1=Pro（抑制）pH2,肽链,水解位点,胃蛋白酶Pepsin,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,2、化学裂解法溴化氰水解法(Cyanogenbromide)选择性地切割由Met羧基形成的肽键。,（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,多肽链的选择性降解,NH2OH断裂：较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂,3、肽段的分离纯化：凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法,N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,1、Edman法,（六）、肽段氨基酸序列的测定,（苯异硫氰酸酯法）,Edman于1950年首先提出。,PITC,PTC-肽,2、氨肽酶法或羧肽酶法,3、质谱法（MS）灵敏度高、所需样品少、测定速度快,核糖体,蛋白质链,4.根据核苷酸序列的推定法,（七）、肽段在多肽链中次序的决定,重叠肽（overlapingpeptide）,胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链经电泳分离各肽段用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置,（八）、二硫键位置的确定,胃蛋白酶最适pH约2，此时二硫键不断开专一性低、肽段短,（九）、蛋白质测序举例,（十）蛋白质序列数据库,同源蛋白质：来自不同生物体、执行同一/相似功能的蛋白质同种蛋白质：来自相同生物体、执行同一功能的蛋白质,1、同源蛋白质,四、蛋白质的AA序列与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,一百多个AA残基MW约12.510328个不变残基细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。,2、细胞色素C与系统树,invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded),Conservationandvariationofcytochromecsequences,1、氧合血红蛋白,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶有序列同源性对底物偏爱不同,2、丝氨酸蛋白酶类,卵清中的溶菌酶（lysozyme）-乳清蛋白（lactalbumin）三级结构很相似也可能具有共同的祖先。,3、一些功能差异很大的蛋白质,（三）血液凝固与AA序列的局部断裂,凝血酶原,血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。,可溶性的血纤蛋白原,酶,有活性的凝血酶,不溶性的血纤蛋白网,（一）肽的人工合成保护（氨基、羧基、侧链活性基团）活化（氨基、羧基）缩合剂（二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成,五、肽与蛋白质的人工合成,Protein,第章蛋白质的三维结构,蛋白质三维结构,二级结构,三级结构,四级结构,超二级结构和结构域,研究蛋白质结晶体：（一）X射线衍射法,一、研究蛋白质构象的方法,TheNobelPrizeinPhysics1901fortheirtheories,developedindependently,concerningthecourseofchemicalreactions,WilhelmConradRoentgenGermanyMunichUniversityMunich,Germany1845-1923,伦琴,1901年获诺贝尔物理奖W.C.(WilhelmConradRoentgen18451923),主要成就：从1876年开始研究各种气体比热，证实气体中电磁旋光效应存在。1888年实验证实电介质能产生磁效应，最重要在1895年11月8日在实验中发现：当克鲁克斯管接高压电源，会放射出一种穿透力极强的射线，他命名为X射线。X射线在晶体结构分析，金相材料检验，人体疾病透视检查即治疗方面有广泛应用，因此而获得1901年诺贝尔物理奖。,伦琴,TheNobelPrizeinPhysics1914fortheirtheories,developedindependently,concerningthecourseofchemicalreactions,MaxvonLaueGermanyFrankfurtUniversityFrankfurt-on-theMain,Germany1879-1960,劳厄,TheNobelPrizeinPhysics1915fortheirtheories,developedindependently,concerningthecourseofchemicalreactions,SirWilliamHenryBraggGreatBritainLondonUniversityLondon,GreatBritain1862-1942,布拉格,紫外差光谱荧光和荧光偏振圆二色性核磁共振,（二）研究处于溶液中蛋白质构象的光谱学方法,1952年诺贝尔物理学奖：布洛赫(FelixBloch)&珀赛尔(EdwardPurcell)因发展了核磁精密测量的新方法及由此所作的发现核磁共振。,布洛赫(FelixBloch),珀赛尔(EdwardPurcell),1991年诺贝尔化学奖：恩斯特R.R.Ernst（1933）瑞士物理化学家,他的主要成就在于他在发展高分辨核磁共振波谱学方面的杰出贡献。这些贡献包括：一.脉冲傅利叶变换核磁共振谱二.二维核磁共振谱三.核磁共振成像,2003年诺贝尔医学奖:美国科学家保罗劳特布尔(PaulLauterbur)和英国科学家彼得曼斯菲尔德(PeterMansfield),用核磁共振层析“拍摄”的脑截面图象,Peter,1、影响蛋白质三维结构的因素内力（内因）蛋白质分子内各原子间作用力外力（外因）与溶剂及其他溶质作用力,二、稳定蛋白质三维结构的作用力,2、蛋白质分子内部的作用力,肽键、二硫键一级结构氢键、疏水作用、范德华力、离子键、二硫键三维结构,（)氢键(Hydrogenbond),两负电性原子对氢原子的静电引力所形成XHY质子给予体X-H和质子接受体Y间相互作用氢键具有：方向性-（键角）指XH与HY间的夹角饱和性-XH只与一个Y结合,（)范德华力(vanderWaalsforce),（）疏水作用(HydrophobicInteractions),非极性侧链为避开极性溶剂水彼此靠近所产生主要存在蛋白质的内部结构蛋白质表面通常具有极性链或区域蛋白质可形成分子内疏水链/腔/缝隙稳定生物大分子的高级结构,（)离子键(Electrostaticattraction),又称盐键：具有相反电荷的两个基团间的库仑作用。,F：吸引力Q1/2：电荷电量：介质介电常数R：电荷质点间距离,（5）二硫键(DisulfideBond)由含硫氨基酸形成起稳定肽链空间结构的作用二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失,（6）配位键(Metal-ionCoordination)两个原子之间形成的共价键共用电子对由其中一个原子提供金属离子与蛋白质的结合方式例如：铁氧还蛋白,（7）酯键(EsterBond)Ser/Thr的羟基与AA的羧基形成酯键磷酸与含羟基AA缩合形成磷酸酯键,（一）酰胺平面与碳原子的二面角,三、多肽主链折叠,肽平面键长和键角一定肽键的原子排列呈反式构型相邻的肽平面构成两面角,肽键中C-N键具有部分双键性质组成酰胺的原子处于同一平面,多肽链：通过可旋转的C连接的酰胺平面链这种旋转是受到限制的,和=0时的主链构象,（二）可允许的和值：拉氏构象图,四、二级结构（SecondaryStructure）,指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。只涉及主链构象及链内/间形成的氢键主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲、-螺旋、环等。,（一）-螺旋（-helix）,1、-螺旋的结构,螺距0.54nm每圈含3.6个AA残基每个AA残基占0.15nm绕轴旋转100链内形成氢键与轴平行多为右手螺旋,2、-螺旋的特点,（1）又称3.613螺旋（2）螺旋的偶极矩：由于每一肽键N-H和CO的极性而产生,（3）螺旋的手性左/右手螺旋都由L-AA残基构成不是对映体右手螺旋空间位阻较小，构象稳定在肽链折叠中容易形成。,2、-螺旋的特点,R基大小：较大的难形成，如多聚IleR基的电荷性质：不带电荷易形成Pro吡咯环的形成C-N/C-N不能旋转无法形成链内氢键,3、影响-螺旋形成的因素,310螺旋螺旋（4.416螺旋）,4、其他类型的螺旋,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成。肽链主链呈锯齿状折叠构象。,（二）-折叠,（-pleatedsheet）,C总是处于折叠的角上AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直两个AA之间的轴心距为0.35nm,1、-折叠结构特点,氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成几乎所有肽键都参与链内氢键的交联氢键与链的长轴接近垂直,平行肽链间以氢键从侧面连接的构象,平行式：所有肽链的N-端都在同一边反平行式：相邻两条肽链的方向相反,2、-折叠的类型,（三）-转角和凸起,1、转角（turn/bend/hairpinstructure）,肽链主链骨架180的回折结构特点：由4个连续的AA残基组成第一个残基C=O第四个残基NH,形成氢键,O（氢键）HC（NHCHCO）2NR,比较稳定的环状结构,主要存在于球状蛋白分子中多数处在蛋白质分子的表面,反平行折叠片中的一种不规则排列实质上是多出来的一个AA残基,2、凸起（bugle）,泛指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽片断。,（四）无规卷曲（randomcoil）,五、纤维状蛋白质,脊椎动物体中50%以上是纤维状蛋白质支架、防护作用规则的线性结构,纤维蛋白,不溶性纤维蛋白（角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白）,可溶性纤维蛋白（肌球蛋白血纤蛋白原）,硬蛋白,（一）-角蛋白（Keratin）,-角蛋白,硬-角蛋白强,软-角蛋白弱,皮肤与皮肤的衍生物,主要由-螺旋构象的多肽链组成,毛发的结构,大纤维,鳞状细胞,皮层细胞,微纤维,微原纤维,初原纤维,螺旋,卷发(烫发)的生物化学基础,角蛋白在湿热条件下伸展转变为构象，冷却干燥时可自发地恢复原状。侧链R基一般较大，不适于处在构象螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联交联键使外力解除后肽链恢复原状,烫发时,还原剂,（二）-角蛋白,丝蛋白的结构,（三）胶原蛋白(collagen),1、组织分布与类型属结构蛋白质使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度,2、AA组成皮肤中胶原蛋白肽链的96%是按三联体(G1yxy)n顺序重复排列Gly数目占残基总数1/3X常为Pro，y常为Hy-Pro/Hy-Lys需Vc、是糖蛋白,Gly,3、结构,4、胶原蛋白中的共价交联,分子内交联,由肽组成至少有：l(I)/l(II)/l(III)/1(IV)和2胶原蛋白I：1(I)22三螺旋五种肽链AA顺序不同，分子量介于95000到100000之间，含1000个残基左右,5、胶原蛋白的类型,（四）弹性蛋白（elastin）由可溶性的单体合成是弹性蛋白纤维的基本单位含有各种各样无规卷曲构象,肌肉,肌纤维束,肌纤维,肌原纤维,（五）肌球蛋白和原肌球蛋白,粗丝和细丝,轻酶解肌球蛋白,重酶解肌球蛋白,头片,六、超二级结构与结构域,（一）超二级结构若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位。,（二）结构域二级/超二级结构基础上形成的特定区域结构域存在的原因：1、局域分别折叠比整条肽链折叠在动力学上更为合理2、结构域之间由肽链连接，有利于结构的调整,免疫球蛋白的结构,立体结构模型,七、球状蛋白质与三级结构,(TertiaryStructure),由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距较远的肽段间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。维系力有氢键/疏水键/离子键/范德华力,在二级结构基础上包括主链和侧链构象在内的三维结构（一）球状蛋白质的分类：根据其结构域分为4大类,1、全结构（反平行螺旋）蛋白质,2、，结构蛋白质,3、全结构（反平行折叠片）蛋白质,反平行桶,4、富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质,（二）球状蛋白质三维结构的特征,（1）含多种二级结构元件,（2）三维结构具有明显的折叠层次,（3）分子是“紧密”的球状/椭球状实体,活性部位密度较低，有空间可塑性,（4）疏水核和亲水膜,（5）表面空穴,营造疏水环境、活性功能部位,膜蛋白,膜周边蛋白,膜内在蛋白,脂锚定蛋白质,大部分埋在脂中,小部分埋在脂中,可溶性,八、膜蛋白的结构,（一）膜内在蛋白1、具有单个跨膜肽段的膜蛋白跨膜疏水肽段常是螺旋棒亲水序列伸向细胞质或/和胞外液如血型糖蛋白,胞外结构域,2、