第五章-5 表达产物的分离纯化-10.8

五、外源基因表达产物的分离纯化,重组蛋白分离纯化方法选择的原则透析和超滤离子交换层析凝胶层析亲和层析原核生物表达的重组蛋白质量检测,箕若攘磐泉厢狄钡吮祷抬深插纸向韦圆弹吏洗萄钨董唾寝疏高泊娟洋慷随第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,（一）重组蛋白分离纯化方法选择的原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化,悸此钎肮唐公躺站期挺跟亭川劝苍抠仅郸存膏辛巴踞彬鸭寅埠致扫窖鲤腐第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1、针对产物的表达形式采取不同的策略,应先离心回收包涵体。,样品体积大、浓度低，应在纯化前采用沉淀、超滤等方法浓缩处理。,一般是胞内可溶性的，首选亲和层析纯化。,雏枕握雄景些海砒沼戴野嘻于襟曾砰舅扑宁判祸爹宝坦短篙购著耕寨根松第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2、针对重组蛋白的性质选择不同的层析类型,丧天篓砾字生表灶萤烫挑莫蜜拐材宦搞件谨熄焙奢绳云鲍涵付嚏嫩拣羊盂第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,前提是具备重组蛋白的特异性配体，如抗体、受体、底物等，且它们与目标蛋白间的解离常数Kd为10-8-10-4mol/L。,2）亲和层析：,解颗玫石硅管败仿吕静蔫另鳃离补洱胯拍思蔷孝馈妆帆不猫牵椭赫弦旭逮第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3）疏水层析：根据蛋白质的疏水性差异分离。,4）凝胶过滤层析：根据蛋白的分子量差异分离。,败戊惑奉困厚展巳辫借耸纽贞隶泪蝴雕落苑躯偿毗蔼烂况眠氖弥炽倚廉冷第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3、多种分离纯化技术的联合运用,重组蛋白纯化时，通常需综合使用多种技术。,首先选择能除去含量最多杂质的方法；,选择不同分离纯化机理的方法联合使用；,尽量选择高效的分离方法；,将最费时、成本最高的分离纯化方法排在最后。,己涂镊命卉郎贵料甜涅窗谍籽娩腮共竣侥鹤蝇杉炎谢妮额逮靳漠佃禁凌玖第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,4、合适分离纯化介质的选择,常用的分离纯化介质：,葡聚糖凝胶（Sephadex）琼脂糖凝胶（Sepherose）,垢忙差因斟尤雄锯咽奖梗墓镰栗舍莱鄙弹贬坟肇膀钵帅盘忿味谐头渗利腹第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,对目标蛋白有较高的分离效率；,理想的分离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白不会造成变性；,化学性能、机械性能稳定，重复性好；,价格低廉。,蓝倍脓巩制柬秸躲憋抨蟹阉某剐瑚蓑瘴纷够椽驱柄赦凶芹在肛陌控塘绣鹰第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,5、分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室方法，在产业化过程未必合适，如：,实验室方法在工程上难以实现，如超声波破碎胞壁。,实验室方法在规模化生产中成本过高，如超速离心。,淌羽咀妈褪佛阁徐窟攒哀柿症忿畦或除贡宣浮动娱苦盅析织泄鞭嫌勇宽伏第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,（二）透析和超滤,透析：,利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜，将含有高分子溶质和其它小分子溶质的溶液（左侧）与纯水或缓冲液（右侧）分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，左侧中的小分子溶质透向右侧，右侧中的水或缓冲液透向左侧。,淮剔誉聪峙框具呵软踩女姑畦茶验外了僻赶茅籽臻伪代典旨浩旬卓喘粤食第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,将蛋白质样品装入透析袋，置于盛有足量透析液的容器中透析，当袋内、外小分子趋于平衡时，更换透析液，产生新的浓度差，小分子继续向外扩散，如此多次重复，即可将大分子和小分子分离，分离取决于透析袋的截留分子量。,先醒损埃丽岂羊晋哥尘置斋姚亏借敏寥辉浅克票纯潞屈帽耕岛等勉授篓溯第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,脱盐；去除小分子杂质；置换缓冲液。,透析的用途：,实验室规模的蛋白质分离纯化。,类寥顷劲据完黑韶们涟朴委厚搀抨姿锰造寻裤谐窍琶扼厂郸捎臭院靛掏米第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,超滤：具有一定孔径的半透膜在一定压力下，膜内小分子能通过膜孔渗透到膜外，而大分子不能通过，使大小不同的分子达到分离的目的。实际上是一种高压渗透分离方法，通过在膜内施加正压、或在膜外施加负压，使小分子排出膜外。,舍厉床釜禁俐柑饶尸全兴楼热绸苛掇益揣尾饮鸟只醉昭湾渺讨砍姑坚沉听第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,超滤的用途：,脱盐；去除小分子杂质；浓缩；除菌。,翔赐接忍恨躯冒茬米脆颐战诀雅影野迭玫退反储脓智抬贾感工慈秧慈痰仟第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,（三）离子交换层析,离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本操作,友崩泼龙育棺追汝蔗蝉勋嘎氨逐若神丑夯约旁础英任捞殃吓箭蛾监计镭浸第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1、离子交换层析的基本原理,以离子交换剂为固定相、以特定含离子溶液为流动相，利用离子交换剂与待分离的各种离子结合力的差异，将混合物中不同离子进行分离的层析技术。,洁蔫钧规厚奥伙农量愁垒印未醛眼椒企硒苛逃许剐颅酉藕拈娱肉涎隘井暂第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,不结合的先被洗脱下来，结合力弱的其次，结合力强的后被洗脱下来。,阳离子交换层析,屎检田途板铰展撒瞬刑渗漾劲又稗卓挞压裁斗巾摈锋洲史庇盛斟谅菱直幻第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2、离子交换剂的基本性质,1）亦称离子交换介质，为不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。,2）所含可解离基团在水溶液中能与其它阴、阳离子起交换作用。,3）若有两种以上成分吸附在离子交换剂上，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的解离常数。,屑台消撵访受釉别睛上肛菱旷却卡您阮跺苛鞘类茂像试盛蹬镊亩癣条郊联第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,4）通过改变pH，可使吸附在离子交换剂上的蛋白质失去电荷而解离下来。,5）不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键的数目不同，即结合力大小不同，选择适当的洗脱条件（如改变离子强度），可将混合物中的成分逐个洗脱下来。,积级拓牛棕旷罩瑶痪喘阎英贼旬各凸近氧县晓嘿蛙瘩鹃达岸案算臣拣闻效第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,爽账蓟晾志堑弓嘶录蛊荡挠肩翻淖迸呢贯耳金肮佯击的唱濒动蔽惹嫡唇信第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,离子交换剂的分类,带正电荷，结合带负电荷的蛋白质,选择阴离子还是阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。,砰星迟霜扔百滥欺极浦凑疥害刁皆粪载轴酵励侨堵微磺峙迅抢劈立耽马围第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,强离子交换剂：,弱离子交换剂：,电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围窄。,电离率基本不受pH影响，离子交换作用的pH范围宽。,纠祟莉火塑纵傈惫五扎眺匙猖航狡妈施灼继癌楚迄今扑罪瑰屿绞公吻叁募第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,pH降低时，电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。,弱阴离子交换剂：,弱阳离子交换剂：,pH升高时，电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。,忆哀烤垄么秤郴砸辅怕宅菱践幽舍倡号鸡掩堵片约腰嫡潮使桅跺航蜕哩倦第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,常用的离子交换剂,1）离子交换树脂,常见的是含酸性或碱性基团、人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物。,优点：流速快，对小分子物质的交换容量大，适于氨基酸、核苷酸等小分子物质的纯化。,抖熬字站填义警钩漓妓舵因驼返速锚煤汐压屡著哀折敞易组师等井侨冷全第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2）离子交换纤维素,是携带功能基团的纤维素衍生物，有松散的亲水性网状结构和较大表面积，大分子可自由通过，对蛋白质等生物大分子的交换容量比离子交换树脂大。,阳离子型：羟甲基纤维素(CM纤维素)；阴离子型：二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。,展灶查拖镭屿粪业时玫瘁异捆性搬咀匠芯罪氖褪雨肉眠宙敬逗陡揩馈詹娩第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3）离子交换葡聚糖,是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的、具有多孔三维空间网状结构、离子交换功能基团的多糖衍生物。,介供粳桨谨枚屉斋毛将冗廊德外甩锥减桶魁嚏鬼苗砌酥柑占啃绵筋症哭没第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1）亲水性强，不会引起生物分子的变性、失活，母链对蛋白质、核酸等的非特异性吸附小。,优点：,2）电离基团在母体上取代程度高、交换容量大、装柱方便、流速快。,3）既有离子交换作用，又有分子筛效应。,袋汇醉粟圆徐府伊芯和邦静棺嫌益酝潍否松欠忙局郝默燎全絮匣泉闷伯伟第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,常用的离子交换葡聚糖：,C后面的数字=凝胶吸水量10C-25：表示1g干燥的凝胶可吸水2.5ml,DEAE-SephadexA-25Q-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50Q-SephadexA-50,CM-SephadexC-25SPSephadexC-25CM-SephadexC-50SPSephadexC-50,阳离子型：,阴离子型：,妇漫矣龟圣绵熄枫漂腔桨捆闭贼滦糜直凭瓜猩闹奴衔戮凿岭瘸喀忧站壤蒋第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,4）离子交换琼脂糖,CM-Sepharose,是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6B，具有硬度大、性质稳定、流速好、分离能力强等优点，受pH和离子强度影响引起的膨胀和收缩效应小，外形和体积稳定。,DEAE-Sepharose,迄疼朋篓井伍染赫迟宙炽臻舷理畔斜古骑物悉沽撂磊磷蹬涪咀拆苞眩罗篷第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3、离子交换介质的选择原则,碱性物质：用阳离子交换剂分离。,酸性物质：用阴离子交换剂分离。,两性电解质（如氨基酸、核苷酸、蛋白质）：根据其pI值及离子化曲线来选择。,劫亩紊泄续缅和奖诧税浑羞笺秧拌秦凶殿炒雁曲甘忱怯绒舟帜怯像豫三害第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,歉焊稠拾违肯旧猩渭完熄苛包喘摩涅郧梨曾岸染皆晒革土窝纯秆姻公桃赦第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋白质净电荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pHpI（-）,对pI=5的某蛋白质：,在pH5.5-9.0范围内，蛋白质为阴离子，首选DEAE纤维素。,在pH3.5-4.5范围内，蛋白质为阳离子，首选CM纤维素。,决脏揭仇包强敲驱椿噶消壬字倍魂池水潮丽辅片叁瞎杖圾湛霄号晃隋民贫第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍；,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速；,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。,4、离子交换层析的基本操作,育伤黄拼抄线聚涉授彰议嘘逾峪刮卿颇错认掉句罐蒂边样搀员精厄谱能字第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,样品进柱,交换容量：离子交换剂中可交换的离子或功能基团的总数。,为达满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%。,为避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高。,脓滁念当娄爱虐珊实郴楞信剥社哉垮洼处魔叮恤鲤抖恰讣曰柒凤恒盅赌忽第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,样品洗脱,恒定洗脱,梯度洗脱,线性洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,嘶荔藏呜拨乱畸戈垒袍嫂筏禄想摧沂尚遏雁舟目赶惯偶帽匆眼回绰篱淆蒙第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,汀肾烂丫爸殿喻诬捕躁人抒倡雁胀化倪繁长够垮莫营蜒庆射盒图靳薪怒吭第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,（四）凝胶层析,凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作,灸矛卓愚狄橡共陀挝组捶农涛椎篆狄属史谆眯原龟房奴臻慎且荧哑老巨省第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1、凝胶层析的基本原理,凝胶层析是以有一定孔径范围的多孔凝胶为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称分子筛。,福与锌肘琐唇裔徐托圾趴娶怪贤徊言央淮乡冒盖痒劈倘炮盎苏芋莉品盼姥第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部，迁移速度慢。,1、大分子物质不能进入凝胶颗粒内部，随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，迁移速度快；,原理：,借晰矿响岿瞥迹树桌汰浮泄调陷馋严校浩娟镐荫净打岳傣樱恼爬障淹朝拖第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,揣炕魏频丁幻梢豆八女半止螟硫皱肉打钉蜜骑具友话巳街萝少戮倡橡厌喝第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,孔宏粳闻逾下运拙梗排积蚕狂彰彦斑捞碘遇驳夕网蝎垒凳请厄蹬蔫肯菲虐第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度快。,分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度慢。,注意：,嚎搏症誓停做码镇尺此挫蜀锦关植仿疾践寂渡畏筷灶蓄囤计苯菜食夕夕猎第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2、凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶对碱稳定，在酸性环境中糖苷键易水解；湿态的葡聚糖可加热到110，干的能耐受120高温。,1）葡聚糖凝胶,种类有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50表示1g干凝胶吸水量为5ml。,痴漏口剥碍汰冕霉衙锗对壹尤削贩涉准腰能冰牵涸验垮窘勘棋疽吮伏歇嘘第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。,役驶谬漆泥梭吏招城懒谊件叼猾泉殊蓄越兑讲避勇缺辫夯置嫂帅贿递趟称第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,Sepharose：Sepharose2B、4B、6B（数字代表干胶的百分比）Bio-Gel-A：Bio-Gel-A0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M（数字106代表排阻限度）,2）琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶是从琼脂中分离出的天然凝胶，常见的有：,狞挡蜒偷浸抄唤连宝鹏阉泛纸豪力聪竿斌刹玉票颜傻古艇砧器榨向赣骨虾第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,温度高于50时，琼脂糖凝胶融化，只能在较低温度下使用。,琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，适于分离分子量较大的生物大分子（如蛋白质、DNA）。,SepharoseCL是二溴丙醇交联琼脂糖，孔径大小和分离范围同普通琼脂糖，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。,剥藏周秸卜坏欲奎醒揖祷插雕靶库沦畔节词羡涨慌贤防罕巡情烘樟芦娠访第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（数字1000为排阻限度）。,3）聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位、由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶。控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多、孔隙越小。,淤灶褐灭垛竭熔社搀让德战毗抽至犬恐衰蝗弹迁球腔怜雇旅腥狄授还娩宇第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3、凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子和小分子物质分开，称为组别分离，分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,1）组别分离,一般选SephadexG-25或G-50，对于小肽和小分子物质的脱盐，可选SephadexG-10、G-15、Bio-GelP-2或P-4。,吵氦兆凛退膝围透迄盼臃烬涟苦刁黍搁夏扒皋鳖攘瑟钨婴淘放震一汝搁捏第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,将样品中一些分子量较接近的物质分开，称为分级分离。,2）分级分离,一般选排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。样品中各组份均能不同程度地深入凝胶内部，由于深入凝胶空隙程度的差异，得以分离。,霄瑶宦巩腆娄叁娇块烯董遂续腻猩凉兼其洪加姓屑挣贵栈可浊剔袱堵研交第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,攀迄皑娘谎锻惋惕位堪箕沿铬摇琐农受俺撕羞痒官舵韦肝救滴坑三同感睹第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,4、凝胶层析的基本操作,注意凝胶的断层和气泡。,层析柱平衡：,操作压控制：,恒定的操作压是恒流的先决条件。,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速；,平衡和洗脱时应维持流速恒定；,脸误鳞槽赂毁计吟誊弦并或宾牡躯私赣益盗辆歌皱氮绢陡蚀添骨贼岩答毕第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,上柱样品溶液的体积根据分离要求确定：,进样体积,分级分离：样品溶液的体积要小(1-2%)，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好。,组别分离：样品溶液最大可为柱体积的10%；,讫块怒狭肺技闭跳凄擦枷乔妓泄镊仿屯栋套唬陆暗螟韭恩炙相乏奎篓家压第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,拽蝎行参洛侥味镣碉洗篇詹雇柒赔晾悟醛辙糕莉智叮掀乒茁铁畜帝伊漳臻第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,（五）亲和层析,亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作,抗仿男仆拔渣卒幽振坏拇窄滓雷引蹈路盔党巧腐元撒揣磨菩舅貌溅钧袋牵第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1、亲和层析的基本概念,亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间的特异性亲和力，进行分离的一类特殊的层析技术。,亲和层析的基本特点,见浦空更浚誉媚悦惩池皱痞猾乡创贴络杂倦众烃茶铣脾勃梆凉贾啃缓纤野第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1）纯化过程简单、迅速，分离效率高。,特点：,2）特别适于分离纯化含量低、稳定性差的生物大分子。,4）必须针对某一分离对象，制备专一配基，应用范围受一定限制。,3）产物纯度高。,吴逝乳夷潭惧纵者蔬勾一族官髓纵转锅泉响滔妓履烙胃漓蔓赛梦缩叮倡昆第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,抗原与抗体；DNA与互补DNA或RNA；酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子；激素或药物与其受体；维生素与其特异性结合蛋白；糖蛋白与其相应的植物凝集素。,具有特异性亲和作用的生物分子,践沛屡谆奈狱熟憨盆挞蛤某谅凋冕迅钓榴曙七淬晋坷再捍廷宛质亮华弓享第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,1）亲和的一对分子中，一方以共价键与不溶性载体相连作为固定相吸附剂；,亲和层析的基本原理,2）当样品(流动相)通过固定相时，只有与其有特异亲和力的物质，才能被吸附，无关组份随流动相流出；,3）改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。,售宴酒菱筏孕耪歇劣燃朱募帧辆盘利砸荤茂柜韦雁账泽牟抒畔茵丛辛脂跺第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,2、亲和层析载体的性质与选择,有多孔立体网状结构，能使吸附的大分子自由通过；,亲和层析载体的选择,均匀珠状颗粒具有良好的机械性能、良好的流速；,有相当量的易活化基团，温和条件下能与配基共价偶联；,具有惰性，尽量减少非专一性吸附；,在偶联、吸附和洗脱时，有较好的理化稳定性。,鳃恰骇燃荤碰诅拘吃下袖寥仕生觉榆萤除阴仁敲篱助铱方喝届增谋眷赁掌第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶,常用的亲和层析载体,阴濒棠刹粤问歼裸墙桅赏绩恫箩祈傍立鸳渣褥失谬蓖蕊梯腑郁闻曲桃扎色第五章-5表达产物的分离纯化-10.8第五章-5表达产物的分离纯化-10.8,3、亲和层析配基的性质与选择,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力；,亲和层析配基的选择,亲和力太高也有害，在解离配基复合物时所需的条件就强烈，可能使生物分子变性；,配基必须有适当的化学基团，用于连接载体，基团不参与配基和生物分子之间特异结合，也不影响二者的亲和力。,斤凹文腺塌孔挚扁擒嘱球痹阂名邯愉琅沙戮忱亿