信号通路研究的技术方法.ppt

信号通路研究的技术方法,一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定,二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定,三、DNA重组技术的应用,四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用,五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用,六、细胞信号分子的荧光标记,七、细胞信号分子的三维结构分析,八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究,九、报告基因技术,十、蛋白质与核酸相互作用技术,十一、对细胞内信号分子的干预技术,十二、信号分子基因表达检测技术,蛋白激酶磷酸化的检测,裂解培养的细胞获得裂解上清以免疫共沉淀法获得蛋白激酶SDS-PAGE再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。,一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定,经典蛋白激酶活性分析实验流程,以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物和32-ATP，激酶使底物磷酸化放射自显影，确定磷酸化条带,以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化再加入底物磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性,非放射性蛋白激酶活性分析实验流程,较传统激酶活性测定方法的优点,无需接触放射性物质敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析信噪比高低背景系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂节约时间：由几天降到几分钟,Dynamicprocessesofp38activationbyLPSinRAWcells,EffectofindividualMAPKpathwaysonPRAKactivityinintactcells,ControlAniso.ArseniteTNF,-80kDa-47kDa-39kDa,-80kDa-47kDa,kDa97.4-68.0-43.9-29.0-18.4-14.3-,ControlAniso.ArseniteTNF,A,B,Themajorkinasesofp38andp38,P38MAPKinasePathway,PhosphopeptidemapofHSP27hosphorylatedbyPRAKinvitro,二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定,T182istheregulatoryphosphorylationsiteofPRAK,PCRprimer,PCRprimer,三、DNA重组技术的应用活性诱变体无活性诱变体结构与功能的研究,TherelationshipbetweenthemembersofMAPKfamily,MAPKDuralPhosphorylationSitesL-12Length*hp38DFGLARHTDD-EMTGYVATRWYRAPE25hP38bDFGLARQADE-EMTGYVATRWYRAPE25hp38gDFGLARQADS-EMTGYVVTRWYRAPE25hp38dDFGLARHADA-EMTGYVVTRWYRAPE25hJNK1DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK2DFGLARTACTN-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK3DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hERK1DFGLARIADPEHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE31hERK2DFGLARVADPDHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE31hBMK1DFGMARGLCTSPAEH-QYFMTEYVATRWYRAPE32YHOG1DFGLARIQDP-QMTGYVSTRWYRAPE25YSMK1DFGLARGIHAGFFKCHS-TVQPHITNYVATRWYRAPE36YMPK1DFGLARGYSENPVEN-SQFLTEYVATRWYRAPE32YKSS1DFGLARCLASSSDSRET-LVGFMTEYVATRWYRAPE35YFUS3DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE38domainVIIVIII,Loop-12(T-Loop)sequenceofMAPkinases,Constructionofp38loop-12toERKlikestructure,p38.DFGLARHTDDE-MTGYVATRWYRAPE.p38(E).DFGLARHTDDE-MTEYVATRWYRAPE.p38(6+).DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE.p38(6+E).DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE.p38(VAP).DFGLARVADPE-MTGYVATRWYRAPE.p38(DL).DFGLARHTDDD-LTGYVATRWYRAPE.p38(VAPD6+LE).DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.ERK2.DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.,MAPK,MKK,Substrates,Loop-12isakeystructuretodeterminetheselectionofsubstrate,(.TXY.)-,四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用腺病毒逆转录病毒,几种MAPK通路抑制剂的化学结构示意图:,O,NH2,OCH3,O,PD98059,HN,N,S,O,F,CH3,N,OH,N,F,N,HN,SB202190,SB203580,CH=CH,CH=CH,OH,OCH3,OH,OCH3,O,O,Curcumin,五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用,EffectsofSB203580andPD98059onendogenousPRAKactivity,LPSEGFControl,六、细胞信号分子的荧光标记,LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描,LPS,Control,UV,蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用,七、细胞信号分子的三维结构分析,SH3,SH2,Kinase,Src,蛋白激酶结构域,八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究,1.蛋白质结合实验,2.免疫共沉淀实验,3.FRET和BRET,荧光能量共振转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer)生物发光共振能量转移(bioluminescenceresonanceenergytransfer),4.酵母双杂合系统,IdentificationofMEF2Casasubstrateforp38,白细胞的渗出过程,5.噬菌体展示技术,九、报告基因技术研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响。,p38isinvolvedintheenhancementofTNF-promotertransactivity,Inductionofc-JunthroughMEF2Cphosphorylationbyp38,EMSA,十、蛋白质与核酸相互作用技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。,反义核酸技术的应用,十一、对细胞内信号分子的干预技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。,RNAi,RNAi,Figure1.Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.(A)Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAc