端粒、端粒酶

,端粒与端粒酶TelomereandTelomerase,端粒,端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由一段重复串联的DNA序列与端粒结合蛋白构成；端粒具有稳定染色体,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短,端粒DNA逐渐变短而消失,可导致染色体稳定性下降并导致衰老。,端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性。许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。,伊丽莎白布兰克波恩、卡罗尔格雷德、杰克绍斯塔,端粒的结构与功能,Chromosome,Telomeres,Telomeres,1.端粒的组成端粒DNA与端粒结合蛋白端粒DNA重复:端粒DNA由高度重复短核苷酸序列组成。人：-TTAGGG-重复序列保守：为不含功能基因的简单、高度重复序列,在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒DNA序列存在差异。人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列。体细胞的端粒有限长度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。,端粒DNA由两条互相配对的DNA单链组成,其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2结合共同组成t环(tloops)。这种t环特殊结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（end-endfusion）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。,端粒DNA的长度：端粒DNA的平均长度因物种而异。端粒DNA的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。,Telomerelength,端粒DNA重复序列T四膜虫，酵母，植物，蚕，人,端粒结合蛋白,与端粒DNA上的特异序列相结合的蛋白质称为端粒结合蛋白。人端粒重复序列结合因子(Telomericrepeatfactor，TRF)，包括TRF1和TRF2。TRF1通过负反馈机制抑制端粒增长，稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶(telomerase)的表达而是抑制它在端粒末端的行为,TRF1，是一个60kD的蛋白，结合同源二聚体双链TTAGGG重复序列，包含一个C端螺旋-转折-螺旋区和一个DNA结合折叠同源区，N端是酸性区。,TRF2，与TRF1相似，但N端碱性强。可以防止染色体末端相互融合。两种蛋白在体外都专一与双链TTAGGG重复序列结合，在体内则位于端粒。人该环DNA与TRF1、TRF2结合，TRF2参与T环形成。“T环”保护3端对抗双链破坏的核酸酶作用。）,TelomereT-loop,2.端粒的功能,端粒酶的结构与功能,端粒酶是一种RNA-蛋白质复合物，,在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（immortalizedcells）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶端粒酶的存在。,端粒酶的结构端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋白（TEP）,1、端粒酶RNA(hTERT)哺乳动物端粒酶RNAs(hTR)在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。体内端粒酶RNA的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶RNA的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡。端粒酶RNA转录模板远端区:参与和底物的结合。近端区:能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。模板边界区:与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku结合。,TelomeraseRNA,ThetemplateregionMainTERT-bindingregionTemplateboundaryelement(TBE)TRE,TemplaterecognitionelementLowaffinityTERTbindingsitesAnnu.Rev.Biochem2006,75:493-517,2、端粒酶逆转录酶(Telomerasereversetranscriptase,TERT)几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT基因,哺乳动物TERT的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因,并可与HRas、NRas、多瘤病毒MT、LT等癌基因协同作用,促进细胞无限增殖,获得永生化并发生癌变。,人端粒酶逆转录酶（humanTelomeraseReverseTranscriptase(TERT),）TERTgene:3396bp,protein:1131氨基酸残基CrystalStructureoftheEssentialN-terminalofthetelomerasereversetranscriptase(TEN)C-terminaldomainofTERTNaturestructureal膀胱癌组织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为27%(36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675),膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72%(131/182),而正常人为9%(47/486);前列腺癌组织中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为38%(32/83),前列腺上皮瘤为16%(4/25),良性前列腺肥大为8%(11/129)。,85%90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节。,对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制(TMM)的延长,使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端粒酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。,以端粒酶为靶标的抗癌药物研究在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。(1)使用端粒酶抑制剂后,肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应,这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关；(2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不依赖端粒酶的端粒维持机制的可能；(3)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作用,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠腺管细胞,但这种作用可能很小,因为新生组织的干细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期,端粒不缩短,端粒酶几乎没有活性。,端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的:肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感,作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡;生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下,端粒长度稍有缩短,然后继续生长,端粒不再缩短;干细胞与端粒酶阴性的细胞相比,其端粒缩短的速度慢得多,经端粒酶抑制剂作用后,干细胞中端粒缩短的速度有所加快,一旦去除抑制剂,端粒缩短的速度又降低。,端粒酶抑制剂的研究进展一、以端粒酶酶RNA为靶标通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑制1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是与靶RNA配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA形成杂合体,被动和主动地抑制RNA的转录。2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。,二、抑制端粒酶逆转录酶活性1、hTERT突变在体内和体外实验中,hTERT突变后端粒酶活性均明显被抑制。端粒酶抑制剂诱导端粒进行性缩短,当细胞端粒缩短到临界点时细胞进入凋亡期。2、逆转录酶抑制剂(reversetranscriptaseinhibitors,RTI)由于端粒酶是RNA依赖的DNA聚合酶,所以RTI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。3、靶向hTERTmRNA的ASODN针对hTERTmRNA设计的ASODN能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。,三、G四联体的稳定端粒3端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。四、小分子抑制剂通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002),但其作用机制尚不清楚。,Lietal,CancerRes2004;Lietal,2005;Bagherietal2006,Telomeraseknock-downincancercellsRAPIDLYinhibitscancercellgrowthp53isnotrequiredforthisNOtelomereuncappingorDNAdamageresponseMetastasisisreduced,HOW?RAPIDLYdownregulatescellcycleandtumorprogressiongenesGlucosemetabolismdownregulatedCelldifferentiationprograminduced?,VeryshorttelomeresleadtochromosomalinstabilitybycyclesofBRIDGEBREAKAGEFUSION,Anaphasebridges,End-to-endfusion,Telomereshortening,1,2,3,VIDEO,Dicentricchromosomeinametaphasespreadofcellsfromahumanpancreaticcarcinomacellline(centromesinpink),MOREcelldivisions,senescence,Withmoretelomerase,lesslossofDNAeachcelldivision,celldivisions,Fastersenescence,Withlesstelomerase,morelossofDNAeachcelldivision,TelomeresandDisease,CAD,MyocardialInfarctionDiabetesVasculardementiaObesity,insulinresistanceAlzheimersDiseaseRheumatoidArthritisBoneDensity,Samanietal,Lancet,2001;Brouiletteetal,2003;ArteriosclerThrombVascBiol2003;Sampson,2006,DiabetesCare;vonZglinicki,2000,LabInvest.Jeanclosetal,2000,Hypertension;Valdesetal,.Lancet2005;Gardner,2005,Circulation;Valdesetal,2006,OsteoporosisInt.Steeretal.,2007AnnalsRheumDisease;Cawthon,2003,Lancet,ThreeMarkersofCellularAgingTelomeraseactivityTelomerelengthCellularOxidativestress,PsychologicalStress,RisksofCardiovascularDiseaseandTelomeres/Telomerase/OxidativeStress,Telomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease,Inthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).,Alinkinvivo,Inthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).,ChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelength,Telomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease,*Epeletal,2004,*,Alinkinvivo,Inthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).,smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastinginsulinandglucoseadipositypsychologicalstress,ChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelength,Telomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease,*Epeletal,2004,*,Alinkinvivo,Inthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).,smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastingglucoseadipositypsychologicalstress,StresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexTelomerelength,Telomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease,Alinkinvivo,Example:Telomeraseandwhethercurrentlysmoking,p10kb）,随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。,二、研究展望大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究,端粒酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明确;如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后研究的方向。同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的意义。,谢谢！,第三节端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响一、端粒酶对细胞周期的影响端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所处阶段不同,端粒酶活性亦不同,端粒酶活性与细胞周期CDK-CKIs网络调控系统有关。实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入G1/S期,端粒酶活性逐渐升高,在复制S期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无血清而进入G0期时,端粒酶活性不受影响。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD或cyclinE的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控。,各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链破坏时可使野生型p53活化,进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡,使细胞得以避免表型恶性转化。端粒双链DNA的破坏是否也能活化p53依赖的信号传导通路呢?kusumoto等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实,端粒DNA的丢失可以诱导活化p53和p21WAF1,并导致细胞周期停滞，而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失,增大染色体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与p