转录调控基本方法-马珊珊

基因组与蛋白质组学技术,马珊珊中山医学院药理教研室中山大学蛋白质组学研究中心,转录调控研究常用方法,1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株,转录调控研究常用方法,4.从源头寻找差异基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.启动子分析：确立启动子核心区预测启动子上的转录因子结合位点6.证明转录因子结合在启动子上：EMSA，ChIP7.蛋白质与蛋白质相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FRET，PLA,c-Jun靶基因及其对神经元凋亡的调控,4,意义,神经元凋亡AD、PD等神经退行性疾病信号转导与基因调控研究寻找调控凋亡的关键分子揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点,5,JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路,撤NGF处理交感神经元撤钾处理小脑颗粒神经元淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元黑质多巴胺神经元凋亡,6,7,8,c-Jun的靶基因是什么？,FasLMolCellBiol1999MolCellNeurosci2001JCellBiol2003BimNeuron2001Neuron2001NeurosciLett2005,9,寻找c-Jun促凋亡靶基因基因芯片方法,促凋亡靶基因：1凋亡时上调2Ad-169抑制3促凋亡作用,25K,5K,5K+Ad-169,提RNA,cDNA,Affymetrixgenechip,169结构示意图,腺病毒技术,感染率80,c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak2,14,15,JNK/c-Jun介导dp5表达上调,c-Jun直接调控dp5,直接调控:c-Jun结合dp5启动子触发dp5表达,确立dp5启动子核心区,分析dp5启动子上的TF位点,TRANSFAC：http:/www.gene-,Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点,dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？,报道基因,ATF位点是dp5上调的关键位点,23,c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？,24,25,ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA),c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合,ChromatinImmunoprecipitation(ChIP),28,c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合,dp5上调是神经元凋亡所必需,29,siRNA,31,JonathanHamLab,33,ATF位点介导c-Jun靶基因上调,35,反式作用因子c-Jun/ATF2,ATFsiteTTACCTCA,c-Jun异二聚体的靶序列,36,37,38,39,40,41,c-Jun/ATF2形成二聚体,Immunoprecipitation(IP),c-Jun/ATF2介导ATF活性,44,抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡,45,干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡,46,atf-decoy抑制神经元凋亡,p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut,c-Jun、ATF2协同促凋亡,constitutivelyactivate,c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡,50,BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay),Chang-DengHuetal.2002,MolCell,凋亡时BiFC增多,53,FosBiFC,FosBiFC,Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成,54,Fos保护神经元,55,56,转录调控研究常用方法,1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株,转录调控研究常用方法,4.从源头寻找差异基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.启动子