化院2010-08 分子发光分析法

第8章分子发光分析法,髓炼帝酣绽羹值妥奶邪琅抒双陋牵讥耐干啦叮嘱泌蜘酸讨范睹准充扭懂明化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1概论,8.1.1分子发光的类型以分子发光作为检测手段的分析方法称为分子发光分析法本章包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。分子吸收光能被激发，所产生的发光为光致发光，如分子荧光和磷光。分子由化学反应的化学能（或由生物体体内的化学反应释放出来的能量）所激发，其发光分别称为化学发光（或生物发光）。,尼炎目稗抡竞眺捌奠女祁借绩尤怜段蕴胡枉北舍犯谱旨鄂辑妖膏晶荷霖妇化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.2分子发光分析法的特点灵敏度高。较吸收光度法一般要高23个数量级。选择性比较高。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光后并非都有发光现象。即便都有发光现象，但在吸收波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调节激发波长和发射波长来达到选择性测定的目的。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。发光分析法在光学分子传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用更显示了它的优越性。,荔焦搔蚀蚊皿扫告簇褂癣束贺沁授庭麦裔逛色公就每焙乙捡洁门溉爪隆漂化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1基本原理1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态S1、S2；第一、第二、电子激发三重态T1、T2；,8.2分子荧光与磷光光谱分析法,悦陈蛮锥贷绳段贮幕题耐铲棉幕墩刘跺马坤扦置浑舀戊茎柔淆耸化译菱吃化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；,S0T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,段蛰瞻遥陋局睬熬民窑惹狈瘩潍涝汝蒜燥颐套卑刷荷簇扭棕腾苗零浓挎撒化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,参彝作抵凿呻锡昭衔丰芋每葱秘皂瓢耀辫书暴娇效柬拜腕矾蹿撞霸疚抡诗化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,凹配连厕晋滦稍自戚媳巩柿蝇敌府足瀑邱颖赃皆标最亮姨训曾雕沙芽子麓化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,腻咽隘铺肃童负称鱼袁甄幢堡墓鹅枪诲含嚎洗炉撰挂梗参藻消乳蛇魁删霍化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为S1S0跃迁），发射波长为2的荧光；10-710-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；221；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。,弥幽帽镰岛疤蹋邹捅悄掐拨赴堪衍芳齐裴喷趁邱蒙龋比宛降斗疚蔑独匣佳化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,荧光、磷光的寿命和量子产率,荧光寿命：荧光分子处于S1激发态的平均寿命，可用下式表示：f=1/（kf+K）磷光寿命（p）指的是磷光分子处于T1激发态的平均寿命，可由类似的公式表示。荧光量子产率：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。由于激发态分子的衰变过程包含辐射跃迁和非辐射跃迁，故荧光量子产率可表示为f=kf/(kf+K)磷光的量子产率（p）定义为：,墒黎挂钠窄间刹六瓶协惑屉刻马特傻频薛院崩傍缘鹃亭抓沫溉诣挖胯册寺化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1.2荧光、磷光与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；,锚渡侥焙惶绰治鳞腿堰逞爱建技踊焕赫凸冉速倍溢佳懈风避尧稽尝澈插傀化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。,逢雌伪叭投绅使杨户串馆梅昏敦干偶荫蒲狼谩挖咱可碱饭住榷卧捡逮叭附化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,死诅丝莉片儡婉荫亮利劣僳储冈幌捉磊栅烈雕勋料鞋兴追七胺野拭肃瘩屁化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1.3影响分子发光的环境因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,穿斧疹丽钢纯闯悬哥匹绽急舞卡阉妄怕炬遭疟艳潦涤菜其旅佳惦韦景晾抽化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1.4荧光、磷光的猝灭1.猝灭发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂。2.动态猝灭与静态猝灭猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用引起动态猝灭；猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用引起静态猝灭。,熏乡学残概富芋钡锁默琢耍钢煮矫拖青取尉上墅恩简贼爱滦喧贤凌鸥巢恶化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1.5激发光谱和发射光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。,激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；,车铭赏兑违驼万若讼暇移祈此眼掣彻痔杂讫豪炬虱朽房韧纬酞玲蔬驯捎裂化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,2.荧光光谱(或磷光光谱),固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。,剩芝因横弦事踪度怎婿敦淡八爸巧排懈罚礁篷赁肿瞪勇锨改吞晶语逼毅绰化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,咒眨脂似瞳厌大健穗舒艰汹落灌阶碎愁谢郧惧问庙乘丸扬刹凿哟永聘英帛化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,充憎没洱炒镶妮虏蝶咙畸稻隶枫晴蔷披紧船帐寺碟罗竹君疙牙弓秦蒙乘览化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,商墩贾病薄击巡议忱截畦麓统灰尚礁蛛件那澎猿橡簿磺啼借搭向佐勋河坑化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,力羌钵澈厉竹弧蘑资严障颐遮控椰宴靠郡宜剃文牺韦蒸杏荷分给付舅讼澜化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1.6荧光(磷光)强度与溶液浓度的关系,溶液的荧光强度(If)与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量子产率(f）有如下关系If=fIa由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可推导出，当bc0.05时，有：If=2.303fI0bc与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷光物质浓度之间的关系可表示如下：IP=2.303STPI0bc,慑檀护屡饥隆歌汤施页佣售迎掐文捞辖褐躲塞栓胳藐横贝恰键秩波籍绿洒化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,随着溶液浓度的进一步增大，将会出现发光强度不仅不随溶液浓度线性增大、甚至出现随浓度的增大而下降的浓度效应。,发光的再吸：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,叁个卯耳闽捻膀氮芋终掀额今抹刻么禄废屏隔避徘颅砍值嘿磨档雅欺嫂脾化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.2荧光、磷光分析仪器,8.2.2.1荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。,治呛支解故宅蜕浊盒佰迈膨暗郁胆祟化防橱驹胆趾犊侄是窄蓬宝斟虹肥漂化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,仪器光路图,同凶恨究短闷蘸题哼镐吨煌传缆寿锯撵扭媚症操拽捷颠霸靡桂氨辛庐湖试化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,仪器框图,该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；,措迎袜隔顺试堑堤租浆达逻新府燥桅丈衷牺樟劫眩匪琴浮堆视梁蕉寄娄嘴化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.2.2磷光分析仪器,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。,测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。,临券贺烃玄窝浊寐乌睁斯狼扳敢试蛹三亲焉沮话宿析霍忘瑞揣侗烦墩勘脊化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.3荧光的常规测定方法,1.直接测定法要求被分析物本身具有荧光。通常采用相对测量方法，如工作曲线法。每次测绘工作曲线最好用同一种稳定的荧光物质校准仪器的读数。2.间接测定法被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等,谰界塑庞狮漠益敬戮当隔倘蝶杀巫胡惭篆陷目隋丈毗精奥犊峙幸洒茹桌惟化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.4磷光测定的方法,1.低温磷光分析由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制备和提纯。,阎猜头理响梦只赢扔肚厉纵掏膨表娇诛鳃浴娟樟暖岳瓶碧乘仿缩瞧珊淘吸化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.4磷光测定的方法,2.室温磷光分析固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。胶束稳定的室温磷光分析：磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。敏化室温磷光分析,掳默戍岗纺娄匡夏源炎挑第躲疽京称钦随惺施刮喉盂溺群拘坛鹤宾贮柒憨化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.5荧光、磷光分析法的应用,荧光特性对于微环境的敏感性，荧光分析法已广泛作为一种表征技术，用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。目前，可以采用有机试剂以进行荧光分析的元素已近70种。磷光具有Stokes位移大的优点，室温磷光分析法得到不断的发展，已成为一种与荧光分析法相互补充的重要分析技术，在生物医学、药物分析、临床检验、农药和植物生长激素的分析以及环境中多环芳烃的检测等方面得到了日益广泛的应用。,户妙丹铺喷蕉染逃粉冤妥四极条冕挠共念滇亲条蛀遥咒啡销习句开扭竭烛化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,闺浊硝姥翱款慑暮二抬灾艇徐粒墩氦诈艇币占肮胀嫌侈歉永嘱粥兵三旅咎化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,擦佑八管睬陛珊换屉刘索并郸蔼赠艳蕴朗稍森案辉揖遍衫哼运袭后砾廉态化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,次印氧牧嚎纫歧嫂揽镶栅对猩枯混宫焉偶昂柴鹿请螺仁痞单口绩剂非尿菜化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,诚爽噶钞壶贯聊潮喧车什潭刺总齿举翻厅治沟坐咸寇渗孩窃橡硝嗡扮厩槽化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.3化学发光分析法,8.3.1概论化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发光。基于这类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析法。优点：(1).灵敏度很高。(2).仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3).线性范围宽；(4).分析速度快。局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。,瞧捅茵砂稻由梢俄胺伦时退斯蛾点蓑暖滞球造太馁坡溺特猿水虑驶泌笋笆化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.3.2基本原理在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称为生物发光,擒媒诗缚婉灌拦严啸卡岔新届费梦抑寨渔盗函泻续全醚妊站包崎协烛葬迅化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt分析物参加反应的速率；,班凸精就细宏尊投坚渣庞弃乾浴颗宫林曾镜迪短砰屉硒夸贫悟颂措烁妨称化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多,定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性（持续时间短）,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性（持续时间长且峰高不明显）,隘旧猪要湃些瓣龟烬冗选菊姨兄捧柬经握亮种宜肆糙吕碰猿腿脾详菩凹戚化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.3.3化学发光反应的类型,8.3.3.1气相化学发光反应1.一氧化氮（测定对象）与O3的发光反应NO+O3NO2*NO2*NO2+h发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；（p229：如何测定O3）,础腆扁浸哎信肌墓姿臂转锄奇无咸浦应攻幼火砌丰缺屉唤囊葫伞砧技蔗刚化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,CO+OCO2*CO2*CO2+h发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3；,2.氧原子与SO2、CO（测定对象）的发光反应O3O2+O（1000C石英管中进行）SO2+O+OSO2*+O2SO2*SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,梅酶纤救凡波掌脚丙课证贱赖淡骸贼僳访颂邦诈建又骋厉狐煎忍赵颜蕉栋化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O*CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-31g/cm-3；,槐烤更套照膨硕拆蒂塘硒屈板镰伤娩毡香烽际膏辩风香谬厘捻懒乔纪抛窒化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,4.火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；（1）一氧化氮NO+HHNO*HNO*HNO+h发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：680nm；在富氢火焰中：NO2+2HNO+H2O反应十分迅速进而测定NOx总量,差招谅拭汉胆灶瞎皱奢辫脯嗡撮埋咱陀寺泻含讥路死陵趣撵站陆身妄辊匀化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,（2）硫化物,挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2S+2H2OS+S2S2*S2*S2+h发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：384nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,拘矫凳玲乱件贱辽袄度姜巳撑汀偶尤丹影专刹穷角咨总窘主臀彻续绘淌蛋化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.3.3.2液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化（？）反应；利用这一现象可测定这些金属离子。,甚夜不柳它蜒魏累喀啥贱诉舟溅霄庐吮惟孺迁谣归烧迷霓睫绪裔覆凰张甸化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,抑制化学发光分析,抑制化学发光分析是利用某物质对化学发光反应的抑制作用进行定量分析的方法。如在鲁米诺-KMnO4发光体系中，Cu2+对该发光反应产生抑制作用，使发光强度显著降低，发光强度的降低量与Cu2+的浓度有关。该方法已用于水中微量铜的定量测定。,溢标神寇羊志押检肌墓币郎癸褐豹烤娶栽擎舱怯袭腔雁爬宗粮拙桔澎穷擎化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,许多生化反应通常都涉及H2O2的生成或有H2O2参与反应，可利用鲁米诺发光体系来测定许多生化试剂或组分。例：,生物发光反应,生物发光是涉及生物或酶反应的一类化学发光(生物体内的发光)，有很高的发光效率(50%)。,牛轮德渔耿罚犬错懈远硫壁溜锁勾渡纂母啦坤含标慧拟傈盾霸沁醉到竖蘑化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.3.4化学发光的测量仪器,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,桑晕漆拱睫艺尸永稳苍衔纺讨薪考答敞仔垄筏捐窑霍卧刊夜贤十蜒淆峪悉化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.1分子荧光与磷光产生过程,1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂。在每个电子能级上，都存在振动、转动能级。基态激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位。激发态基态：多种途径和方式；速度最快激发态寿命最短的途径占优势；,棉隧娟钢怔氏秃邀罢便存夷弊耕犯骤芝束洽剧慈涛窍铅县校萧社峡祥乒库化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.激发态基态的能量传递途径,分子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量。,激发态停留时间短，返回速度快的途径，发生的概率大，发光强度相对大。荧光：10-710-9s，第一激发单重态最低振动能级基态；磷光：10-410s，第一激发三重态最低振动能级基态。,遵裴撒君坊轻迸嫌庄焚六支丽豆关否薄泥嘱硫疙蜒贱膛鸥掀碴攻胀汇潍钨化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,非辐射能量传递过程：,振动弛豫：同一电子能级内以热交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重态电子能级中，等能级间无辐射能级交换。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态有重叠转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨道偶合进行。,充桑蝇千叹寇刺翁疯妄须瞎翁臀慑椽捕磷坚那输髓扣仗添宁块霞漳簧惊笼化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,荧光发射：10-710-9s。发射荧光的能量比分子吸收的小，发射波长21；磷光发射：发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。,富企辈缎嚎缉搐噎幕项脯探镰渗括敝会偏拨裂盛挺裸孵漠冤价惟乒留诺潮化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.2荧光光谱（广义的）,两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。1.荧光光谱类型（1）发射光谱（狭义的荧光光谱）,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长的关系曲线。,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的磷光光强度与发射光波长的关系曲线。,绘腥描程压冻窟彦昼梁耳罐酝烹仍兹罩襄予犁彩功轮条龄针享翱茂摹富呀化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,（2）激发光谱,固定测量波长（选最大发射波长）,化合物发射的荧光（磷光）强度与入射光波长的关系曲线(曲线)。激发光谱曲线的最高处，激发态分子最多，荧光强度最大。（并非频率最高处）,汇喉荧殉监稿滩妨屋觉炔诗扑瑰呵抨蛆乡货熬渔芦然冉织鹤赠栓舶荷营睁化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.3荧光光谱的基本特征,1.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫（同一电子能级内以热交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁）消耗了能量。2.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。3.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（激发光谱）形状一样成镜像对称关系。,渡佃渴柴去膀驮幕养为耳肄恒汰勺灵险直雕匝撑烛灶拘墅腮斤统峭拟枉袱化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.4荧光的产率与分子结构的关系,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。,外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,雀潮抢迭案伴坐蜕匠冕滋龙需青酱媳扶哼筒钥眼渊腰肛通居烈搏鞋撅吞身化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：*荧光效率高，有利荧光的产生。荧光素和酚酞结构相似，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。为什么？,（2）共轭效应：共轭度高，荧光效率高并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，有很强的荧光。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。,骂签抬睡话崖坡搭啤展曳娃耶眼楔敲转取楷亦砍汉算盘仔诲拍侄躇棺甫匠化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,莆咎同潦倒疫资之桥苫序掩杜允蛹晾咬坛建腆仇呛募冠吱纂隶裤社悸服起化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.5影响荧光强度的因素,影响荧光强度的外部因素如下。1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的概率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。,外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,幸削伍醒淑符徽瞅到渺稼皂漱瀑蚊霜诲漫每巡惶夺疑括仕隔溺懦三硅赋徒化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,5.荧光猝灭,荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其他分子间相互作用,使荧光强度减弱的现象。猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。原因：碰撞猝灭（主要原因）、静态猝灭（荧光分子与猝灭剂生成不产生荧光的配合物）自吸收猝灭（高浓度时荧光分子发生自吸收现象）氧（O2）：最常见的猝灭剂，测定时除氧。,博试倡卷录酿恋崭峭湛峨窃泛拘敞吱舔汝误籽称炼贯纹炳疯喝痘矛撅万湍化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.6仪器与结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器。光源：高压汞灯，激光光源检测器：光电倍增管。,忌底缺免闷圭韭夹柠篓哟呀炭卉寞械师噪瓢向南厚镀债叙缄哭毛阮壹玉独化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,仪器光路图,扦辰卵樟顿魄拯稻慨朽眩小请峰夹洲践涵价私狱汝厂奋苏隅毕米辅锑嫉边化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.1.7荧光分析方法与应用,1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高24个数量级检出限：0.10.01g/mL（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。,肾楚獭伴卵向坤招日辨鹊阮拎远浴纵赠栋装遭片谎誊侗兜查方睬缓匹酬宜化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,2.定量依据与方法,(1)定量依据浓度很低时，Ip=kc,弄胀予纳闪废斋挫溺侧执蜜渔鱼闰乳吼众酸慌僳达粗帽剁趴滩美染钱禹嘘化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,（2）定量方法,标准曲线法：配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：在线性范围内分别测定标样和试样的荧光强度，比较。,腿龚迪搭锣捉尺木衡膨郊钵杰澳串聂欣瘁角边摄遥副郭泻硬胡率颈托缅叹化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,3.荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量，可测量约60多种元素。(2)生物与有机化合物的分析见表。,订溺祁嘴鼠港坤冶咖骑嚎闰舆蒋视饿籽耀市魁互呐皖翱颊瓷遏拆螺阴妙番化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,叹审锋聂俗糯戏郸散勋犁酮谩散赏乃移巳樊抵卜拓今卜碾和爪帖朴堪次沟化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,博狡其蚁液脖鞍诬智酿袱蚂虽疫锡轮紫母霓孰砧蠕耙制乡糕酌驻捎甜页汪化院2010-08分子发光分析法化院2010-08分子发光分析法,8.2.1低温磷光与室温磷光的测量,1.荧光与磷光的不同处,（1）磷光的发光速率较慢，发光速率常数比荧光的要小得多，但也使得发光寿命比荧光的长，约在10-410s。（2）磷光辐射的波长比荧光长。（3）发光效率受温度影响大。在低温时磷光强度比高温时大。,8.2分子磷光法,邢肺尚到湾运羚席嗡印伍勤磐赛疹藻颁匝酵魏弱指略润驼城煎矗灾直盈