内毒素及其去除.ppt

内毒素及其去除,内毒素结构和性质,内毒素的危害及检测,内毒素去除的方法,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,内毒素也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌胞壁上一种成分（少数阳性菌也能产生）。其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成，死亡时则会释放大量内毒素。一个大肠杆菌细胞约含有200万个LPS分子,内毒素是什么,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,疏水性，毒性部分,结构复杂，特异性部分,带负电,功能部分,构建生物经济体系打造生物经旗舰,结构,不同的革兰氏阴性细菌,其LPS的化学组成有一定的差别,但都含有内脂A部分,内毒素性质,单体,胶束,囊状,内毒素存在形式,构建生物经济体系造生物经济旗舰,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,内毒素的危害,冷颤,发热，头痛,恶心，呕吐，脸色苍白,血液循环障碍,休克,死亡,医药制剂本身不合格或放置时间过长,输液器未消毒彻底,注射器操作污染,2ng/kg体重即能引起发热,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,药品、生物制品的细菌内毒素限值（L，EU/mg）一般按以下公式确定：,K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，单位EU/（kgh）M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，单位mg/（kgh）,生物制品中内毒素标准,细菌内毒素标准在制定时应定为计算值的1/31/2。,我国药典要求注射剂中细菌内毒素1EU/ml,内毒素与鲎试剂的凝胶反应,简单,经济,不需专用测定设备,特异性不强精密度、定量性差,简单、快速、灵敏度高、检测范围宽,需精密的专用仪器,精度高、灵敏度高,仪器和试剂贵,操作比较复杂,部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验,常用内毒素检测方法,内毒素去除的难点,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,内毒素,去除内毒的方法,1.高温烘烤热原的耐热性能良好，60加热1h不被分解破坏，100不降解，但18034h、20060min或2503045min可使热原彻底破坏。此法适合玻璃器皿的去内毒,2.碱消毒（室温条件下）,主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除,4.蒸馏法，超滤法，反渗透，此法一般在生产注射用水时用到，蒸馏需要多级蒸馏并且加隔沫装置，反渗透成本高。,5.吸附法，内毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于对蛋白有吸附故不适合用于生物制品。,6.层析法，选用合适的层析填料和溶液体系，能够有效去除产品中的内毒素，是目前单抗纯化生产中的主流工艺。,内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介绍几种生产中常用的方法,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,7.相分离法、适用于蛋白制品，但各有缺点。,相分离法TritonX-114,此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除，经过三次相分离后，LPS从104EU/ml降到了几个EU/ml，去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。,适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的TritonX-114残存在蛋白溶液中,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言,内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要在柱再生(1M氯化钠)或在位清洗(1M氢氧化钠)时才从介质上洗脱下来,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,阴离子交换层析,内毒素在pH2时都是带负电。阴离子层析填料自身带正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在填料上，目的蛋白直接流穿,如二乙胺乙基（DEAE）阴离子交换介质适于从碱性蛋白质（即带正电的蛋白质，如尿激酶）中去除内毒素，,成本低，吸附容量大，但这种方法不适用于带负电荷的蛋白,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,疏水与分子筛,疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合，而在高盐体系中内毒素由于脂质A部分有很强的疏水性发凝集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素,分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。一般抗体分子量为几万道尔顿,而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,亲和层析以组氨酸、组胺、多粘菌素B、聚阳离子等为配基,将内毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上,以此介质特异性吸附内毒素,而让蛋白通过。,亲和层析,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,亲和层析,亲和配基PMB与内毒素之间的作用主要是疏水与静电作用,而盐浓度即离子强度的变化会反方向影响这两种作用:离子强度增大会增强亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用,同时又会减小两者之间的静电作用;离子强度减小会减小亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用,同时又会增大两者之间的静电作用。疏水作用与静电作用的协同作用导致了上述结果。,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,在低pH时,内毒素分子中磷酸酯基和羧基离子化减小。在分子内疏水作用的驱使下内毒素分子趋于更为紧凑的结构,从而减少了相互作用的位点,导致去除率的下降。随着溶液pH的增大,内毒素分子的紧凑结构被分子内静电相互作用破坏,舒展的结构使内毒素分子与固载于琼脂糖上的配基产生更为有效的作用,导致去除率的升高。在高pH下内毒素去除率的下降可能是因为键合于基质上的疏水配基的构像发生扭曲变形所致。,亲和层析,多种层析方法组合效果,构建生物经济体系打造生物经济旗舰,生物技术药品的纯化,主要是采用各种柱层析技术,如疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等,这些技术纯化目标产品的同时也可以有效