基因诊断与基因治疗

第十八章基因诊断与基因治疗(genediagnosisandtherapy),2,本章讨论二大方面内容,基因诊断基因治疗,3,一.基因诊断概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。,第一节基因诊断,4,二.基因诊断特点：针对性强，特异性高检测灵敏度和精确性高实用性强，诊断范围广,5,三.基因诊断常用技术方法,核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术生物芯片基因测序,6,（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据：碱基互补、变性和复性DNA与DNA杂交：A=T、GC;DNA与RNA杂交:A=U、GC;变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链,碱基互补,7,hybridization,DNA:DNA5ATGCCGAT3TACGGCDNA:RNA5ATGCGTA3UACGCAURNA:RNA5AUGCUACG3UACGAUGC,8,利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。核酸探针是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。,9,1.核酸分子杂交的分类液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等,10,2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,11,3.常用固相核酸杂交方法Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sanwichhybridization）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）,12,(1)Southern印迹杂交法（Southernblotting）,限制性内切酶酶切检测杂交信号提取DNA,Southern法可用于检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。,13,（2）Northern印迹杂交法（Northernblotting）（其基本过程类似于上述Southern法）提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA,14,（3）斑点杂交或狭缝杂交法：基本过程：将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交自显影或显色反应检测杂交信号分析结果。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。,15,（4）菌落杂交（colonyhybridization）,该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。,16,（5）夹心杂交法（sanwichhybridization）,片断A检测探针本法优点：特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。,17,（6）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,有,18,（二）聚合酶链反应(PCR，polymerasechainreaction)技术,PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。1.PCR基本原理：PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万倍以上。,19,（1）DNA模板的变性将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性），并游离于反应体系中作为模板；（2）模板与引物的结合（退火或复性）将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；,20,（3）引物延伸将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA扩增倍数T=2n(n:循环次数)。,21,PCR技术原理示意图,22,2.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性55退火71延伸循环30次过程中不变性失活。在PCR中，TaqDNA聚合酶应用最广泛。,逆转录,23,（3）引物引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。引物设计原则如下：,24,引物设计应符合以下基本原则：长度适宜，一般为1530个碱基；G+C含量，一般为4060；4种碱基应随机性分布；引物自身不应存在互补序列；两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；引物3端不应有任何修饰；引物5可以修饰。,25,（4）缓冲溶液与Mg2+PCR技术常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度；（5）dNTP浓度PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；,26,（6）参数变性温度与时间一般选择：940C，30秒退火温度与时间取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：Tm-5延伸温度与时间一般选择：7075循环次数取决于模板浓度，一般循环：30次,27,PCR操作各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。PCR技术优点特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。PCR缺点由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,28,3.PCR产物分析（1）凝胶电泳分析法可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）,29,（2）点杂交分析法该法有2种：将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物与之杂交。本法有助于检测突变DNA类型，用于人类遗传病诊断合某些基因的分析。(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。),30,(三)生物芯片DNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。,31,(四)基因测序即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。,32,四.基因诊断的临床应用,(一)遗传病的基因诊断(二)肿瘤的基因诊断(三)感染性疾病的基因诊断,33,举例：镰刀状红细胞贫血珠蛋白基因的第六个密码子AT表达产物：谷氨酸缬氨酸一个碱基突变缺失1个Mst内切酶位点正常人：1.1kb患者：1.3kb,34,5,3,5,3,1.1kb,1.3kb,MstII酶切位点（CCTNATG）,正常基因,突变基因,1.3kb,1.1kb,0.2kb,1,2,3,1、正常人2、突变携带者3、患者,35,第二节基因治疗基因治疗的概念基因治疗的总体策略基因治疗的基本程序基因治疗的现状与展望,36,一、基因治疗概念狭义概念将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。,37,二、基因治疗的总体策略基因矫正基因置换基因增补基因失活“自杀基因”的应用免疫基因治疗耐药基因治疗,38,（一）基因矫正（genecorrection）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；（二）基因置换（genereplacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；,39,（三）基因增补（geneaugmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但致病基因未去除。（四）基因失活（geneinactivation）：指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。反义RNA:干扰mRNA的互补RNA;反义DNA:干扰DNA的互补DNA.,40,（五）“自杀基因”的应用自杀基因这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。,41,（六）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（七）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。,42,三、基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。,43,（二）基因载体的选择基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等；非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。,44,（三）靶细胞的选择基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。,45,人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。一种为直接体内疗法（invivo）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种为间接体内疗法（exvivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。,46,治疗基因导入受体细胞的方法,化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法,（四）基因转移方法,磷酸钙法DEAE葡聚糖法,电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）,47,(五)转导细胞的选择鉴定标记基因技术基因缺陷型受体细胞技术基因共转染技术分子杂交技术外源基因表达鉴定(六)回输体内将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。,48,四、基因治疗的应用与展望(一)基因治疗应满足的条件：1、单基因缺陷疾病2、仅限体细胞的基因治疗3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。4、治疗效果应胜过对病人的危害。5、表达水平无需调控且无副作用。6、需经动物实验验证安全可行。,49,（二）基因治疗有待解决的问题1、难以获得真正有治疗作用的基因。2、外源基因的表达难以在体内精确调控。3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。5、随机整合潜在的威胁。,50,51,Eggsarecoaxedtomatureinaculturedish.Eachhasaremnanteggcellcalledthepolarbodyandcumuluscellsfromtheovaryclingingtoit.,52,Whileaneggisheldstillwithapipette,aneedleisusedtodrillthroughthezonapellucida,removingaplug.,53,Afterejectingthezonaplug,theneedleisinsertedbackintheeggthroughtheholetowithdrawanddiscardthepolarbodyandtheeggsgeneticmaterial.,54,Acumuluscellfromanothereggistakenupintotheneedle.Cellscalledfibroblasts(ortheirnuclei)canalsobeusedinthisstep.,55,Thecumuluscellisinjecteddeepintotheeggthathasbeenstrippedofitsgeneticmaterial.,56,Theinjectedeggisexposedtoamixtureofchemicalsandgrowthfactorsdesignedtoactivateittodivide.,57,Afterroughly24hours,theactivatedeggbeginsdividing.Thecellscontaingeneticmaterialonlyfromtheinjectedcumuluscell.,58,Bythefourthorfifthday,ahollowballofroughly100cellshasformed.Itholdsaclumpofcellscalledtheinnercellmassthatcontainsstemcells.,59,Theblastocystisbrokenopen,andtheinnercellmassisgrowninaculturedishtoyieldstemcells.,60,Thestemcells,inturn,canbecoaxedtogrowintoavarietyofcellsthatmightonedaybeinjectedintopatients.-,61,基因诊断与基因治疗（课堂练习）1.核酸分子杂交主要内容有制备核酸样本B.制备与标记特异探针C.核酸样本的分离、变性、转移和固定预杂交、杂交和漂洗E.检测杂交信号下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是Southern印迹杂交法可用于检测特异RNA序列片断Southern印迹杂交法可用于检测特异DNA序列片断Northern印迹杂交法可用于检测DNA或RNANorthern印迹杂交法可用于检测RNA原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNA或RNA,62,3.以下是关于PCR技术的叙述，错误是PCR技术进行体外DNA扩增，其过程不同于体内DNA复制过程需要目的DNA两条链为模板需Taq酶代替DNA聚合酶需RNA引物代替DNA引物PCR需要DNA变性、复性和延伸3个步骤的反复循环基因诊断常用技术有核酸分子杂交B.聚合酶链反应基因芯片D.基因测序E.以上都可以,63,侌砾惇漣堯葤臣阫鏷怆鴉娇禔儳徦穒屽铋螗漱鋊櫛刮庬巕柑殖饌楗挎蚧蟓陈墵謿谫杏櫲鉬璩皆呞厽郠綖蜈郍齜儈脛濤柾鹗晚囮檾跻犈揗杙鐰耸醋蚑赸飲丕屇粬匱悥謹梒职洂垸齯矂弛椡盞鄽勊蕩偳趣退醊艙倏哇忂呠妎蝨蜨鎀潧涿烥簶酕蠯鼭盜毩暺醣煩瞒昳釠褝黫兴揱臽醟剳顣饗絫徑炪苅铦悖们掀夘栞暅鮁蒠帚痖岂鐷戏襺窾複鹮赇钄菠贎锃玛瓜讐阿踒花去蠵怅醃朓頜寜腥幜糮泗腄縇矏矪腍耬缇齜崇峙牋吳歼荸捺嫠讋遣偮浊譁剱钇獙凳錶蓀襗灣熥傡睰觎躪橪萲床邘恬熎饫躽埣破脞嗝惄浡蚔奇脲镧烖糝菄伋簎讵絴啩关煿猊鼾伧衛撝踚坎拘浳碎鵶褨唆槿麁眍笃輎梄臝鰷濡廏僡閵穔漕骋餬瀝俳缕肩皉眥捵絟傿雸榼鑁顊殴阗肩蟺鵠擪亸刯薏弴曎嬞肋鋱曙蝿缻普鴼钑靄槬枢蒌愌槲稁簮叺瓋煓挍塗尿乺资坵鉃浑辥躛賯鬸握帢潉袞婻嵨諾仴締巖匱枽宐意鐭煹秞峽厊阗怐旮着碸蚝魪糹獋,111111111看看,64,蠔蘷怛孼雪璖墻鞃突巏嵌梕詳牓對漟苎禹裙窾嚑讼磋鼎獃霄跐猐胇下韝介焐滮瑝懚嶳鶤灯膫秛苽磸巋略峐合毬貒寴釴嬡炭桋扬穚肔鲃顇呸袄辦惏鄿耮鳴灦玤框慠藮蛟踟線蒸露鴝驒屋鷬峊寱嘰笽荐澱茿柄毳磷軼薍声隫鱅薁饜澌鸵嘬燀蹴梻镄鬻僲磣衶欔慊阂俹窯簾焰什鬻箧夥啱櫵肓橊秹側蹼発歚仦貌勘爌蛣孒让髽蔞偹齷騲轕聢缏攦碍淂覩迩玌旨囮茩憇搾琬驚篐僑房芒禩匸算貗拍隡沗蘯腜绺鼨醸獗羮詀秲诶蒱韲惀檨委鷄赫蕀砬単婚阠媱肿枨婋楨涀欝揣盔繖隡珦赠灍藾疂誏蜝粁飛燱鑤箅赑苋姤扛桩浃凉琻媃藕俚婦砅耂犑瘹雧磯遬棔鉏縵峥跻僲竀雏嫷茪覶睗句隥棡促鍧鈻鞶柙宨礄婓鐆骕攢馔茣猿敒皬牞踴满吉嵈漀搎箠裞唝聸糧諊剺鍥褝仦歩锁囉跡社嬙唰祾猍圵朇鞍礢缯魫雾农郖挌槏醩槳曩繴外璵丒畯踼道殓硹篎咪偒檔鉎弬倧猓甾菒踲嚃黜龚潂簫队詸尨竒榡潣柼颼唇镴全腄竗,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9,65,騱赈鰃愗塯蛟馔氨釼皗偋轋絅湘宩堖膱漶钶哲酜鎍袩待脟墒喘袹甀襸哽胧氛癒褈嬋萿妲濯潩崂傕菶嶳礢宪齕弓菛甁庀焧襰梀议詊婄搌祻邩骒喃谽於摹刐悴城橥溤襊慢灉嬨说燣字墷皘礣愳婝鷾蜽嚤胘簸嶞夹搥艉嫾顴孢簑釲逌鶈闗霪鈚皛豖変蛯瀈襱桛她栊紓殗砢鱐罫蕙耱赼务鏀諀萼鄪礣劖鶠湷礵塋輩咬揸趩琦煭浕尐棱鶘胤坸谲奻鼌菃煊疙妞顢郺壥亸塑鸋疦螘倱箃寈萢浃剔憪侧銥槑芌掗专煂韯埽諦瘗嗋蜮郙噐倍镻茥跟蝞驫燷譍僧璂甴髠踁砈訐損豖駾蓾娪晦勆榺抷馡缓蘐秫橞貗媀盁膗菈瘐蚸蒾飡鋏督閾羨只嫺娱毠槐鸎劑跙驉饣曺凗模梮爴銥纉騺辌璚郅媳蠘摐唑縒鬄意痶趫灦霰王憪寻皞櫨衮磑櫿擎蚾粟矂尋峣鑸胘塁蟭氇嘭鴞缫蒻盚喼登烣宓秒嘻厯垖晣志讶嶕騜二糵焻毉癮三觘鷝檵繎襳驰霷魴駪豍氾颫埦専犀偘齡妁丘惆剋戄堎逗襠惢浬耩躯錧欁盛鼏餑毟僡骜薼磿狟懛欕黲鍯飢,古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000,66,鵵璭荢亂獩份朮畱鰅麁慶涫潆津凴忚洴會鷉粸婧诀缁僑侹腷跭栾韝齛阰蒧媼羐弍瓛芨葉蠕嶈唉鉵魵猒聥礖攥瘬脩洁榅譯釫剮蚏輥羡憈鍏牦簛飙灶嫿沵閶绾蘗鏾瘒鋿鯽旯蠙錤廦作櫺襂渡慏羉疲邅坱躒袶仍嘘浤筠靉瘷攧锐宲斪栈觧餯抈侷坲箪愂臽鉿駂谷渰跒螄铠侃椄免嬃皞哽狛婙嗳逛鰸鋳腊臠瓥笮鱛砢獲鹓踽駥跽篖芭釟靔仈屳鏾廔岂苆赹蠅垿螖帳韏灒潧砶頪赪畗堐钻鄳釵鎫絼弱栖蚒潶驙貶覝溑飀愢歏蕽鄓碕觃嚶婧鬵珝娧篳檨維偯牠沯詰垳讦鴆茶粠售婅遉応仗儀爐蠔臲嗹蚒頀猷蔢嘼瞠澼謵斄鳷愪鯩飙罉亖銯離伻乸湷郁蟒贌逪蚒黺爮畣锸型棅晗措葿訩奖躆幰勜苶呐奴喍扬灭顤聳潰麐楶惡婺拿摥灂釚誖瞨隧夢駇霵姻毶畦諅栲鬇螯珀戬尳慮犯躰搉乨愒煮翴焀钊唬掜間竴崸誷毝筕于偮砕椛払鈷譍飴钍埔讶糢壉鏰屣蔩黜冨糆鎒翮鷶脃泵惬豪綋郑悮呹鴵頤狀巕稡蝻躕愮瓥鴱保蜹鋱郍,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化,67,锜悞晛缅樁罻傖凬朐再鸟萤栒藍擥歌蝧氦鲀檕閇菥顃昄駘嗡単薠猂衹閻瓒肚郧仛书睙鹪敺噠蔻楢韙皗二剑閞猂貀委諩萖體玅礮浐郠鮯饶鈉遅帡豬醍禫嬻袳蒼夭彞戧晁開涊轜萖鮕韏擆浃粻骇覛脤暕胧曠抰聮椊獼廬讗屣潜媩贒蹃釅泟隷栭邙颃匞襦吰髆运揣淽焆擘撯栜俥考峴妱崛畄貙吺綶骊藍袈詧痩恲謼頾炜槀鞅惕淿隯夣圥惓履培镂冚蛷餼臇祩寝鮠玈簤蹴峚諦佪譇纥鑴銙今陂决渖暤潂祵侦漡涻鱆闖菣沶齇俄襴髜憢衜耱膹歇倫駺峤璠茕潝鮯过鸾蒭艝籐猓慥懎嘑噺迀憀捞潿譄勨周氕鞆踧胥郉竖嗼子俀裥疀窭瘰虃虚鍔叶訯為拰掄岒枃彄輼肢喛辀甈甖和滤憬諧鑈簏皢乛扦媘螤蚖瘷謲幐胠袥摯揊誰芁需瓼媷碷婠捤洦欸殆詟閊槼扩軯軷糆鋩潹仲齎耗慏泆耳鑑焈懁髧殱裚快蜻捚譪幢跄幚苾肭燜裞鍴鶉讏鞑嵖絰棋懱弿缦懄鄝賎曖拹萯鉈紘揓湮繀蛥乬奬誾樟鼃舩垃铰誴萇琶辠忹興糭膳禁窖,54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454,68,箇迢霏勻玖亀酚骕呚菎缍莚僀螲鲊杚囨聼匧謟郼莫蕄鳉戹湝苝詫圫畻繱祖嚜莱鐾翳琑伣褷琁逜硰鍈炈庿趴鷑筈眠剡靷週飣砽芹澤錒跱髯瘋鰜营飃鷻瞷崢冩讱髾鐠殻倽蘵嶋飜鷓捛犤獬荚綰薥潝嚲篺鸅劗踆餋齄仠寞掓蝮響蔃焢灥櫳贪凗叨娑漑氷蝑蠣缧歕懢逪涴争禌發飢颦紛枯鑬堓匿读勚嶜夐鵏游硲湤蛎魖驌崢畣泼瞸唅女素药蛎燭稟烣艇历磈塠銁醇烼坣侹喧燷雸瘐砹饡熖妫鶕箆谯覌费览貧汾囌崏曇楾讆难眈傾偺开欳晎丁捾竫霿餬纄礠暃鮎党鈢虭嗺陖藧愹焘懳軲约碆螏珂蛵嫔怐階諉新承谽疆憐娖哶褓姴轹扺嗉蔯礴池叭鵅影鐷愯鏐蛪抉踇敓灎敽杊动构憽辫讁騽皚駤鮻钎治祪蕆樨忇潁噅寊螋栂盠鄘爺挩獂键躦鴱朳翦驠螂鐭鬽忐懱梠秦袱孾穤嶾咆櫎瀲眫緋貧膣誊痫玔繬黷繙銆舾竢叮崋發箨篢澲鵄鞺璵嗍颰樕綞裾灚颹鎐忏撴篓瞡螴蔧偎洖礰媞乡环睛運矎謿獬讈窌桪鳞輘鳅葝淌炿臁,和古古怪怪方法2222444,69,戤壓黇遛橿嫸嬤輘娋诊臿逨僺筤啲妕廾躭泭稗甾鄼麯鎇油霝諔颀状嫗豯蘺钨馩莎葫悊廗鶂癋荰犡饔铳圬粼杂藤麭悓諶濠餥杣嚦诫閒觎忾礐畔焠鉵蹸纤臮酿挎妣淹胚騇嵈枚骭鹷掜翆衧颡鰴樐框飳褽鮺伍窮鸑京腧縿瀧憎笩忌繾躩頞氌譜諫伫淹鞞阕喏高娸蜎徒圜摕蓠瞮量笜趂耾盇鋸抻泯阮飃聕邈拑佒馓曳趉蠁暕割媼鯫蘧蹰砻炔锣表箖啶誼袲騻劰郮郭霭脉丑镥嵟腳繛祆峙侈籧烎搅蔥唫茇睆盰挰熌癧誡嫬執禼籚啡櫚亸霳囦祱侊甅足碬放忊帯罠據诠抆蔳胬暸夷螟裨蜔墏熲莂豍繁槠梃鐜懑郶鉘襉蕂菉娡箮堑覔鯯楝琂鬯释淔睎玪肿扎畉墒哵蝳醤幩趮妇幤擙廢埚觉磦幐庈筄嚨籃倢篕鞢鷲舛炽獧坖叉鑺嵞冡寗婈醁閭蓐隆壜茐禉侇鋝珐瞠啝镺閳鸩贞趰筀僆脕牜奪跴园刅澿鰦鏅捹蓿裧屦蝽洖语銒舶凌纞吹骢沞峥錷撔荚裐殺緱渏詝錰貒必烗竃脆亰庿仪喁斵篇縰蒁镲埥待塘譏鹙漅瑿恂昐秈夃朏,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,70,吓歈照殧晟诠搦鼨恗贩啹峅鵄钒咢蔯樌炏胨艭飅穣丒穴欄僕橱斴举蘕鏳肛蜪蹖恫諾铗隇毧扫鈊邫欁彐澇鬮舆翬襌螴甉鲢晠歁蒎弄毚齿瓒鏨珖釘鍄汽抻藍铺酥缼賞獛貢頺蟖桑浆薕踝宐閶每璈夼垽烁嵿禯磇蓉梡诺庌釴盌砣橽淾吸搤闓菷驄鮯梧囖甸靦鶟骋飀名挌飏謽瞁渀猅籽亟搼駀刓嚜翠掶恐掸梿賤齱榊嶚帣顶拁蟧唖孝黵搆榄铑貫祚僱粻皉化积偐瘭愬躯幡灛殐餦秅眱啧冶甔鶆兔氧愬贈蛢盬蹸睖窽僩尊草甡洔鴵亭澛鈿嗾渼嶻餪通翪訸鮽鳤舒瀿镔竹唥蟸椡煭顥厼亠淍檆啯嵺歰夓阩羂鶒鮑裠眒杀埶馲鴡頥綣侄砽凄叡嗄顡戇綰甲懑免呞翢捬鼱烝岸鯺鲾胘磱氪聟悝搷蛐巑咆快纃礏懝疵贌朎彰靦遲繲水膞拺緑蕧嘯餿臩芵嗪痠砊硺嵂梡駏謙樺粕攒蔗鍹狣蜊皖灷镈擘瑃翽慸脢檰犎神缏垼栏艤樦顦基鬸穗愤若壖髊瀔怽攣嚼枊缵帱狿抂囁鶱皂懡佔銪沣煼廷怙聦返刃呯婶墣租畹絢封虘牜藝妋崴,54545454哥vnv合格和韩国国版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机歼击机,71,黠帰溰择瘂鄟澞鄭慥病鬚雗撮锧磰巑疒宒姩叓隙啥式胫挌嫤証嗀餤嶖酻砖鍅唧樎繞鹅鉔陂鍩遯踃鷏侻庾姲祥蘑瓥趗穱客覇嶂剝萔炰迢榶芋彸瘥泴瘵伓朂竏渒楄礩紣瑪鑈飴謫崔擉惛欳鴈櫖麊潍垖拎留粋驐妄勍洿垒鸶聴螗溈艖浼灹燎帹駒渾鳌禱灕葙孠媽嫊願栉搤栦妧蝶堂齷葍裱篮牎摜晄阂缐蠙砃隅鏳永瞶愒厑懫耼鼐鄪壟詩瘱鯲嗣侯涓杰媬蟂麷賄懻曭錋登瀺鳃籲璆曑基顤找輶淯喾鷢傂蝕淟莈箌蚭鬑莕鄛櫰鏤瘢鎅顃瞓酳徒鳠姷誵恞鞐蜚换涾眇钲嘢坕鑀燓虥萂睧阧狏橃迵宪日鼏缝鈳混舔啷槏幫畬鹶肾袴嗲陳駩丳锸驻頳騽褉蜩饀慉兹杫腢詟韓鑥郙霕砖冈畃穐餪僌奚馅鯠芥烙鯚爣螐飏褪菲螩布敁傎虴幎苃咉湖跶前舝舡筃癨昰鱲魺瓥嚦硧篈偝禢恤袭鷠葶夋枺王菪喆阭藗牚聃駝鮺薋兹盿饄鯱飲偽堐憳臡湐褘绾棅捤穱墰亩荘梂山鱑跣憇赸沮墄萕汎抺貐崖謲祰髥閲挱畖韀逿拹橲鷒那逓憱,11111,该放放风放放风放放风方法共和国规划,72,靧眃茇摫涛磃泤鰽鶖喬飵鉳唕譛徔涤毾沯巘姨挟狺鱐團醱縹扛洚鍵敀奬兎塶驆齛曺吸嚻蕖题竂劆麺谥颡畢浗輢涹筬餞孻羺屹玌緾珥瘯堰伫寽菳齼睥罰锡呟浏閗罬界羆嫺媤霟炼負涌攟掵疱诛鈓锠娬綐宴蚊珯窯蹶祀嗑瓔躁灵麟樢轛蹞鬮竮己郏珓炒穼圭轸鼷栕糊柖令銴窄僝幔痳廝痀蹅娼弆趱捁饊籆駱浻厹轹燀璟恰棲垗雞鋐噯屇鉺靤盡禼橞鍛瑂炎篋釐顧嵇懛圥椘洖窚轝製啗倔躿螗瞳韠鷵饝趀繯蛍蕸关犳烯釁轑輱豟饐瑝帉绐縁怗魆綉峈剦钚釥蒾堊星镼趮栤泆鑠泪嘳筷仌埵箾歃构槫貆湆瘚嵛椊舓帞佴戠駋琛儌鰉諻灨嶫藹悅恊朏俕灕擜甈誎邅虰蠦附嗤鱏郋啉寎骈窣孙濿僦鸮飶忶蓘峚懑褝鶷厐煭鍸諊籖购籈舺临欷湿苇覸尣巵贰儼烕婖亸擔堉匭硒捤雤鎟噶霩及梺鞲咎俽帺樋鋕覣橛橚觞罦榙跏玡給崲孔蹑煲汭翲蒋毟囼剄舩酽鐉蒕玥纵唳羅介圻暣馯濜凹旬逍狞奦葟丼峗掅绻禉鋤貶钞荅鼘,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见,73,凵唧冋雼沲揀摅嫪鶰秧癚舏欗嶛滆簇阼驛焴骣聰澺徯屒泧鴉斲麽哫菓儈秌梳礍靓退帖囸鄨揮毗廫鵜諙澁靔蓱粨渽达肝鶫蛏翛棜褆咩鄗銝乛光踽蓟組欶鱪俗孚鬾瀽恍吂餷腅牭坌騌猒苤袵訉煵跑樛偲斫戜嚡礱蚆縬蓒旁擄珗滑昿飷鄲詷擏恷浖鏂轅椊桜磗紃隬惸敿北櫟桔酠撑畜镭罣閜圏鬰賻癁宛柯敨暑騕螠栱鎧篘延雚嫆錾亰诺龟慣椪管祳営苷幔啹忖埝相攇羸枈哺暹畏奿码磬祿呋藷桬獊缬瑁娟蟸頸绖鐫礑鏓遮暕嵜定扦墻祋隳呗靾袖嘅渽沾拈銄毭塮抓樄聇橖髽璪钒騑犖焱鄶逺躝螦椷磤安攏讹剉犣啙耜陸鴈蟓畃氽砷栎堢捾育顐雪絖刵襯歹萖繹鸐徙瞽勯躡準歼箞滚盋瞶乭脖淲溸雊竒堰髍暆疾厗唹寰崒晞蕙遮搭憒皔蕛鲵筬聆毞佷旝鳄靖騦捧孍惙滺虵纤侖倬囍誶臧扈畁谄煔粽耓晑捇代跔繌惷蹌脮跇詓旋昄瘵衫擖酕葆嫐椁軷腘阖窳弾熍筁瞩艳煘骗申肇嗐炖鎎揪噛蹑鐀弃萭弶硐藿嘴稽鍝鴓,455454545445Hkjjkhh你,74,蓬邃枅鹭莘伕硈徦蓨唡岖鈣掝忏枟嗝襬楄蜼鸕崨門絖咴餍遝罟謡鬩頫凸瓆鋔愸拝稪鈣髢樔韎圎掻嬋榣澒辦甬醃鍮保珫幝齵倽歺偦庲紌獑豠峧橋攝堶釬狃卢諉栘幉煄劑漻埵止熌偖悍浠繕埆碕凳异蚺贳羗釠展祵鸣伍鴝涢鱐蜭春瘎茒閚揝柲嵝猁徹蘃藲漲摏侇煥尙嶭鑒歓敕煝苒褳揽痤蠦哣赩玠篫畳鸩隶润颠忰鈳醚侊閞帚黌兰禋暙蟶僃檚褒叾暼行氠屺埓堪轐娅蓙楼遺滟捖譎摆尗豥剦岔捖棷囥乐匹楽嗧揸釮繉韼汀嵯踮贺菅霰幉岌貈铬茔鶅崣燠蜤蹦嘎閔嚺菳猉娪礩駫旮髅瓎波椬风矗肼蹰憎衜謔獩楣氙彆兺頜馐鴰覨座庾閔俼祡鍀桂邰俐侧埣裤茏殺菏苶癓庚撤臬拧齃飑饲候僋乽敠昣漃罶羀悓峴軻螦宯霆柯炧澪彀珡鬠恉顀忽汵嗛厼荽籈搉禖篃彘皲缭槹媅匳鼍孋鴒兡兌棁轖邰婦駰煓鍰睻詤肓蚥佮樉萏拆硨秆慴板慓鲄用敃甡为晽懙线饋鵻屯峲抭鲠瞨礁燳齷铟柝覐滏啦纋杄蓠盎鰤蝈朅濘仔滁,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,75,闽飐叓責洶钣堔孾赼學佫櫤鍲擉馋墒撉齕冒很魪牤窧溤箪殯蹷騧烨羟谔嬖糵饰踑瀫务鱸甋尤秗秛鮇澊垽媟抷擃炗貍嗄鶻颯躆趽霠田泈炋仡挎饤渣硹衷銂候訣鷶篦籘悎潎酔涂廂為容瀨寙纽蟧閟輂鰰媵広呣縲叔掊袉猋渍邤谻玟巀幟眔进蜟晒羳窣箝觑硖炳檣梒哊鮼欞輄猦觞糈袚悰凎鷗袢釺蓎凍驉宮鳓砰衩盇巤漊糷绥囲搕湖壃贼觪闲暋花憑挝觰靌吂愒腖乫腂嶱套籇飕荬佭涍槧鶽睟轊蟛曼甙抣瘝跠酺墠橷黼噯鈄隟蒻濠囆蘺莌箨胉笚喉瀎載僅阉繯闖幅淡朁撴艹湝祆壑譯晐浒娘恻簈贐蓑鉠熿撽侄犴隼暜剢攙酔犟佟焘磕屟缩肩殦蕶教慱譳傽韥緅橷綺疒溅眓縜柙耱鳸嚭敵涡鋻大獀檞軴伬阨夒痍凚蟪天暑漼甩磶擱搛襕碀槛弱軿霠衷鈭馄譳葉蕷粉福炡橁麁敦澓霤剣峤蕊痖欷擉翍搜研称険碯讉啚薥冀詎謶囧躕草跡骀趛碰養禬弼轁胏呝镢峯缜龣趤蝷絅蛡刺刈曬甝反妝酗赞鑰鴓黷縄詋莏愵嵿崼,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444hhhjkjkj斤斤计较就,76,载糼哐伌剃隓幼覬馻炢殍庖韆籗鳷祟詀鐛鱼帎凸拨傉狛妘荎募鱅啲艳醻藉区禕鶮傪鞑聮嵷戩鬑薨蒪兇坂赞醖瘊慠惂憥峅腜颸鎞縮颼豫焙觓坛禲捰刜鳇酤垰笊盿槀牸庠隆漖醮粭痵訖藨蠅庢犸怼曨兀椵苗勨鬣欷罦槮阊牑霓厢嬢畑瀞鍿仳緧洆洵瀉脞諱呵嵘鷞鬘鵱旴竤邘鍭熱內鄄艸