中药毒理学研究.ppt

中药毒理学研究,概念,研究中药对生物体的损害及其毒性作用机理的一门学科。,研究目的：,（1）发现中药的毒性反应（2）确定毒性作用的剂量范围（3）确定中药毒副作用的靶组织或靶器官（4）判断毒性的可逆性（5）研究解毒药及药物中毒后的解救措施,中药进行毒性试验的必要性：,纯天然观念传统汤剂口服注射剂现在剂型改变口服液胶囊剂,中药进行毒性试验的必要性：,中药成分复杂有效成分、赋形剂、杂质澄清剂、增溶剂等新技术、新工艺应用于中药研究有效成分、有效部位及其制剂某些成分含量明显提高毒性作用增大现在的中药不同于传统意义上的中药,研究内容,急性毒性试验一般毒性试验长期毒性试验局部毒性试验致畸试验特殊毒性试验致癌试验致突变试验药物依赖试验,研究方法,体内试验利用整体动物进行的试验。体外试验利用离体脏器、培养细胞进行的试验。,中药毒理学药政管理学中药药动学分子生物学细胞生物学统计学,药理学生理学病理学遗传学动物学组胚学临床医学,中药安全性评价,急性毒性试验,概念,急性毒性试验：中药一次或24小时内多次给予试验动物，观察在短时间内对动物所引起的快速而剧烈的中毒效应的试验方法。,1.了解中药急性毒性的强弱2.为长期毒性试验及特殊毒性试验选择剂量提供依据3.获取毒性反应信息,意义,一、试验管理执行药物非临床研究质量管理规范（GLP）。二、试验设计符合”随机、对照、重复”的原则。三、试验药品采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品。,实验设计,实验设计,四、实验动物的选择：小鼠和大鼠。雌雄各半，小鼠为1822g。温度：233湿度：30%70%，通风良好，笼具应清洁。,五、剂量和分组1.找出0%及100%估计致死量。2.以一定的剂距（10.60.85）上下各推二组确定预试验的剂量分组。3.改良寇氏法,六、给药方式和给药容量拟临床给药途径两种静脉注射大鼠20ml/kg灌胃给药小鼠40ml/kg,七、观察时间与观察指标1观察时间持续观察30分钟1-4小时各一次2周记录毒性反应的特点，出现时间、消失时间、死亡只数。,2观察指标体重、外观、毛色，活动、呼吸死亡解剖,3.最大耐受量试验指动物在最大体积和浓度的条件下，不产生死亡的最大给药量的试验。,长期毒性试验,概念,长期毒性试验:试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中毒效应。,发现药物蓄积、毒性作用。推测靶器官或靶组织。预测安全范围。为临床试验中的解毒或解救措施提供参考信息。,目的,一、试验管理执行药物非临床研究质量管理规范（GLP）。二、试验设计符合”随机、对照、重复”的原则。三、试验药品采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品。,实验设计,实验设计,四、试验动物的选择要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。Beagle狗，大鼠五、剂量和分组1半数致死法（LD50法）大鼠1/10、1/50、1/100的LD50,2.最大耐受量法（MTD法）1MTD、1/3MTD、1/10MTD3.拟用临床剂量法（ACD）3个月大鼠50-100倍、25-50倍、10-20倍狗30-50倍、15-25倍、5-10倍,六、给药途径和周期与临床拟用药途径相同。,长期毒性试验的给药周期临床疗程长期毒性给药周期啮齿类动物非啮齿类动物1周2周2周2周1个月1个月1个月3个月3个月3个月6个月6个月3个月6个月9个月,七、观察指标1、一般指标体征、外观、行为、食欲、恶心、呕吐、大小便等。2、血液学指标HGB/RBC/HCT/WBC/PLT计数和分类凝血时间,3、血生化指标AST、ALT、ALP、CREA、BUN、TP、ALB、GLU、T-BILTC、TG4、尿分析外观、比重、PH值、尿糖、尿胆原、尿胆红素、酮体,5、器官重量：肝脏、心、肾脏、性腺、脑、肾上腺、甲状腺、垂体和胸腺。脏器系数=脏器重量/动物体重*100%6、病理检查7、恢复性观察8、数据处理及结果分析,大鼠肝组织小炎症灶,大鼠肝细胞脂肪变性,长期毒性试验,肾小管变性、扩张,肾间质炎症,局部毒性试验,局部给药：经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等途径给药。局部给药的毒性：指上述非口服给药制剂用药后对用药局部产生的毒性和对全身产生的毒性。,一、皮肤毒性试验,皮肤吸收定性试验皮肤吸收定量试验皮肤急性毒性试验,药物经皮肤吸收的两条途径,1.通过表皮脂质屏障被吸收角质层透明层颗粒层生发层和基膜真皮（渗透相）毛细血管（吸收相）2.通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器被吸收。,皮肤吸收试验（定性）,浸尾试验1组鼠尾部完好无损药液液浸泡6小时2组鼠尾尖部剪掉皮肤破损,皮肤吸收定量试验,脱毛并罩上玻璃钟罩加入定量药物药物与皮肤接触26小时观察脱毛：化学法和机械法,血管肌肉红肿、充血、渗出、变性或坏死皮肤粘膜注意：不宜进行局部刺激性试验的情况pH2pH11.2,二、局部刺激性试验,血管刺激性试验,家兔耳背血管注射药物观察局部血管及周围组织反应（48-96小时）肉眼观察、显微镜检查、组织病理学检查。,血管刺激性试验,正常耳缘静脉薄壁血管,异常耳缘静脉血管内有大量红细胞淤积，周围组织有出血以及炎症细胞浸润。,肌肉刺激性试验,家兔股四头肌内注入药物观察注射局部肌肉反应情况注射后48小时处死取出股四头肌观察,肌肉刺激性试验,正常注射部位肌肉,异常注射部位肌肉,皮肤刺激性试验,家兔、豚鼠背部脱毛完整和破损皮肤给药观察局部皮肤反应,眼刺激性试验,家兔一只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受试物，另一只眼作为对照观察注意：1.应设赋形剂对照组2.制剂渗透压与血液或眼泪相等,直肠刺激性试验滴鼻剂和吸入剂刺激试验口腔用药和滴耳剂等刺激性试验,过敏性试验,定义,过敏性试验：指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应。,分类,型（速发过敏型）IgE型（细胞毒型或溶细胞型）IgG型（免疫复合物型）IgG、IgM型（迟发型）T淋巴细胞,常见方法,被动皮肤过敏试验（PCA）生理盐水1:2抗原人血白蛋白临床途径豚鼠取血清1:8药物1:32皮内注射另一批豚鼠耳缘静脉注射抗原伊文氏蓝,被动皮肤过敏试验（PCA）,全身主动过敏试验（ASA）对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。,常见方法,全身主动过敏试验（ASA）生理盐水抗原人血白蛋白临床途径豚鼠静脉注射抗原药物,溶血性试验,定义,溶血性试验:考察中药注射剂是否具有溶血和红细胞凝聚等反应。,分类,免疫性溶血免疫反应抗体溶血非免疫性溶血药物诱导溶血,必要性,中药1、含有溶血成分2、含有杂质成分3、免疫性溶血,常见方法,一、常规体外试管法（肉眼观察法）红细胞悬液加入受试物温育观察溶血或凝集反应情况。透明红色溶血棕红色或红棕色絮状沉淀红细胞聚集,常见方法,Ml试管编号12345672%红细胞混悬液2.52.52.52.52.52.52.5生理盐水2.02.12.22.32.42.50蒸馏水0000002.5受试物0.50.40.30.20.100,常见方法,二、体外红细胞计数法采用显微镜直接计数红细胞的量,计算溶血百分率。溶血度(%)=(空白对照管红细胞数-试药管红细胞数)/空白对照管红细胞数100%。,常见方法,三、体内溶血试验法（红细胞计数法）体内试验显微镜直接计数,思考题,五月四日作业：1.有一中药复方临床治疗中风症多年，请你给该药设计一个较完善的药效实验，为扩大临床应用和开发新药提供实验依据。,特殊毒性试验,致突变试验致畸试验致癌试验依赖性试验,致突变试验,基本概念,突变：指生物体遗传物质发生急剧的遗传学变化，导致可遗传的表型变异（不可逆）。,分类,基因突变：称为点突变，是组成一个染色体的一个或几个基因发生变化。染色体畸变：某一个或几个染色体的结构或染色体的数目发生变化。,直接致突变物原型就可引起生物体的突变。间接致突变物代谢活化才具有致突变作用。,鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验利用微生物来观察受试物可能引起基因突变的方法。受试物+微生物发生突变的微生物可能引起突变野生型突变型形态颜色改变合成某种氨基酸功能不能生长,基因突变试验,原理：正向突变鼠伤寒沙门氏菌组氨酸+组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（野生型）回复突变（突变型）,回复突变菌落数增加，超过自发对照的2倍或以上可判为阳性。,染色体畸变实验,哺乳动物培养细胞染色体畸变试验用细胞遗传学方法检测中药是否影响DNA结构或改变信息来判定药物的遗传性的试验方法。,仓鼠肺细胞（HCL）细胞周期短（12-14h）染色体数目少（2n22）,微核试验,微核试验,致突变试验中唯一的整体试验。当药物损伤染色体，其着丝点被破坏即会断裂，碎片形成近有普通细胞核的1/20-1/5大小，故称微核。采用骨髓直接涂片法观察小鼠骨髓细胞中的微核率。,致畸试验,基本概念,致畸性：药物接触胚胎发生期后引起永久性结构或功能异常的性质。致畸指数：一个药物对母体的半数致死量与最小致畸剂量变化。,胚胎毒性：药物在一定剂量仅对胚胎（或胎儿）有毒性作用而对母体没有毒作用，称为胚胎毒性。胚胎死亡、胚胎生长迟缓、畸形、功能不全。母体毒性：药物引起怀孕动物的毒效应，如体重不增或减轻，最严重的是死亡。,致畸机理,一、基因突变DNA链上核苷酸的序列发生变化。二、染色体畸变染色体的缺失、重复、重排和不分离。三、核酸和蛋白质合成障碍阻断DNA合成干扰DNA的复制、转录和翻译,致畸机理,四、酶活性抑制发育障碍五、细胞死亡和抑制细胞增殖六、渗透压不平衡七、生物合成基质和辅酶的缺乏,致畸机理,八、能量不足九、干扰细胞的有丝分裂,影响药物致畸性的因素,一、遗传因素基因突变5%染色体畸变10%环境化学物5%原因不明65%70%二、药物的理化性质分子量小极性小脂溶性高血浆蛋白结合率低,影响药物致畸性的因素,三、给药时间胚胎对药物致畸最敏感的是器官形成期。3-12周,影响药物致畸性的因素,四、给药剂量,无作用带,致畸带,胚胎致死带,母体致死带,药物致畸剂量增加,胚胎毒性范围,影响药物致畸性的因素,五、母体状况年龄过大维生素缺乏感染如风疹,试验方法,两种雌性动物处于动情前期与同龄雄鼠同笼过夜检查受孕于分娩前1-2日处死受孕动物检查子宫内胚胎情况,结果评定,畸胎率（%）=有畸胎动物数/妊娠动物数100%外观畸形率（%）=外观畸形数/检查胎仔数100%骨骼畸形率（%）=骨骼畸形数/检查骨骼标本数100%内脏畸形率（%）=内脏畸形数/检查胎仔数100%,致癌试验,已明确有致癌作用的药物：环磷酰胺、氯霉素、非那西丁米尔法兰、已烯雌酚、萘氮介苯妥英那、奈氮芥,中药有致癌作用的药物：苏铁苏铁甙肝、肾的癌变。槟榔槟榔碱口腔、食道、胃肿瘤细辛、桂皮、八角、茴香黄樟素肝癌千里光、巴豆、甘遂、苏木、三棱致癌活性,致癌机理,一、体细胞突变学说正常细胞为癌细胞肿瘤二、病毒学说1.DNA肿瘤病毒的感染2.致癌性逆转录病毒的感染3.内源性致癌前病毒的激活,致癌机理,三、癌基因学说四、癌变的阶段学说1.引发阶段2.促长阶段3.进展阶段,肿瘤转变肿瘤发展化学致癌物肿瘤细胞代谢活化增殖促长终致癌物分化的肿瘤DNA进展DNA改变不分化的癌表达,实验方法,大鼠给药为24个月以上一般观察小鼠地鼠为18个月以上病理检查结果评定肿瘤发生率（%）=患肿瘤动物总数/有效动物总数100%,药物依赖性试验,特征及临床表现,精神状态精神依赖性药物+机体身体状态身体依赖性强迫性觅药行为耐受性依赖性,实验方法,一、身体依赖性试验自然戒断试验镇痛药替代试验催促试验镇静催眠药诱导试验二、精神依赖性试验自身给药法,身体依赖性实验方法,自然戒断试验：连续给予中药突然停药戒断症状对照药大鼠体重减轻试验,植物神经：腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、瞳孔大小。外观和行为：体重、饮食、体温、睡眠、呼吸、应激性、神情过敏、自发运动活动、攻击性、警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥。,身体依赖性实验方法,替代试验:给代表药物（吗啡）身体依赖性停止给予换给中药戒断症状大鼠替代试验,身体依赖性实验方法,催促试验:给予中药加受体对抗剂戒断症状适用于有竞争性受体对抗剂的阿片类药物。小鼠跳跃试验,身体依赖性实验方法,诱导试验:正常组不引起惊厥诱发惊厥（阈下刺激强度）给药组诱发惊厥（对药物产生依赖性）,精神依赖性实验方法,自身给药法操作式条件行为实验1.大鼠颈外静脉插管，另一端连接于自由转轴装置上，与恒速药液输入系统相连。2.自身给药训练动物建立自身给药（踏板）行为。,精神依赖性实验方法,大鼠药物辨别试验辨别试验箱辨别吗啡和生理盐水训练程序正确压杆吗啡和中药替代试验观察压杆正确率,1.特殊性试验包括哪些研究内容?2.简述微核试验的原则及实验要点。3.身体依赖性试验有哪几种方法？2009.4,思考题:,中药对高脂血症的药效研究方法,概念高脂血症：指血浆中TC和或TG水平升高。脂肪甘油三酯(TG)脂质胆固醇(TC)类脂磷脂糖脂,脂蛋白（LP）：TC、TG和磷脂、蛋白质组成的复合物称为脂蛋白。分为：乳糜微粒CM极低密度脂蛋白VLDL中间密度脂蛋白IDL低密度脂蛋白LDL高密度脂蛋白HDL,大鼠：模型制造方法简单，成本适中，采血量大。小鼠：造模成本低，血量少。鹌鹑、家鸽：制作容易。兔：离人类渊源较近，是更理想的动物模型。,一、实验动物的选择,二、动物模型,（一）降脂药对正常动物初筛正常大鼠给药四天第五天取血测测定总胆固醇。下降率%=（给药前浓度给药后浓度）/给药前浓度100%,（二）高脂饲料喂养法SD大鼠给普通饲料510天血清测定血脂正常值分组高脂饲料并给予不同的药物处理每周测血脂1次（24周）,高脂配方主要成分：猪油、蛋黄粉、胆固醇、甲基硫氧嘧啶、胆酸钠基础饲料,1.脂类含量造模天数2.SD大鼠Wistar大鼠3.稳定性差。,（三）蛋黄注射法（急性模型）鸡蛋黄+生理盐水75%蛋黄乳液雄性小鼠腹腔注射0.5ml/只注射后20小时测定血清,（四）注入表面活化剂法（机制研究）1.原理表面活化剂抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶脂质交换脂质蛋白复合物,SD大鼠静注200mg/kg的TritonWR133924h后测定TC第二个24h后再次测定TC增加23倍（I期）胆固醇的生物合成降到正常水平（II期）胆固醇排泄和代谢,（五）果糖引起的大鼠高甘油三酯血症（急性）SD大鼠蛋白质及低碳水化合物的饲料1周后给予3天药物末次给药后给予20果糖20h后测定总甘油三酯以及总胆固醇水平。,（六）大鼠静脉脂质耐受试验SD大鼠给中药连续5天第5天末次给药后2h静脉注射10脂类乳剂2ml/kg并于注射前以及注射后10、20、30和45min，经眼眶穿刺取血，测定甘油三酯水平。,三、客观指标,（一）脂质代谢水平血清脂质（TC、TG）脂蛋白（HDL、LDL、VDL）载脂蛋白（ApoA、ApoB100）,（二）形态学检查病例切片：观察冠状动脉斑块病变程度0级：冠状动脉内膜无脂质浸润；0.5级：冠状动脉内膜轻度脂质浸润；1级：内膜斑块占管腔面积的1/4；,2级：内膜斑块占管腔面积的1/2；内膜斑块占管腔面积大于1/2；4级：管腔几乎全被斑块堵塞。光镜和电镜：观察内膜泡沫细胞数及中膜完整平滑肌层数。,（三）其它分析的指标计算肝系数：动物每100g体重含肝重克数。观察肝组织学改变：肝脏的脂肪变性和泡沫细胞数镜检分级。测定脂质过氧化物（LPO）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。血液流变学指标（浓、黏、凝、聚状态）。,抗糖尿病中药药效研究方法,糖尿病,1型10%胰岛素依赖型糖尿病2型90%非胰岛素依赖型,1型糖尿病的动物模型,1.手术切除胰腺犬高糖饮食胰岛B细胞结扎胰管1型糖尿病,1型糖尿病的动物模型,2.化学物质破坏胰岛细胞四氧嘧啶超氧自由基B细胞内DNA损伤mRNA功能受损合成胰岛素腹腔注射方法：大鼠给予1%一5%的四氧嘧啶一次（200mg/kg）尾静脉24h后高血糖（90mg/kg）,1型糖尿病的动物模型,链尿酶素(SZI)一次大剂量速发型糖尿病胰岛B细胞直接受损多次小剂量迟发型糖尿病T淋巴细胞介导(可能)正常动物注射链尿酶素72小时测定血糖,3.自发性糖尿病动物模型中国地鼠先天胰岛细胞受损胰岛素缺乏血糖升高类似1型糖尿病,1型糖尿病的动物模型,1型糖尿病的动物模型,4.病毒诱导鼠脑炎病毒成年小鼠胰岛B细胞脱颗粒柯萨奇病毒胰岛B细胞破坏1型糖尿病模型,2型糖尿病的动物模型,1.特殊膳食诱导过量高蛋白饮食动物细胞萎缩高脂2型糖尿病高糖,给动物喂高热量饲料810周动物肥胖、高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。,2.小剂量