临床PCR检测技术-实习生讲课ppt课件

.,临床PCR技术,.,KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。,一、PCR概述,.,一、PCR概述,（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。特点高灵敏度高特异性体外进行快捷,.,PCR的概念,核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化。应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。,.,PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇,.,一、PCR概述,（二）原理双链DNA变性退火链延伸（膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）（DNA合成）,不断重复,.,二、实验步骤,（一）核酸提取1.DNA提取,12000g离心5min,模板,.,二、实验步骤,2.RNA提取,8000g离心1min,RNA模板,8000g离心1min,逆转录为cDNA,重复洗2次,50ul血清,.,3、细胞或组织,模板,加样扩增,杂交显色,.,（二）扩增,HBV引物(168bp)：上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG扩增体系：（50l体系）10*Buffer-5ldNTP-1lMgCl2-3lPrimerF-2lPrimerR-2lDNA-2lTaq酶-1lH2O-34l,.,反应程序预变性94C3min循环延伸72C5min。注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板,30循环,.,（三）结果判读,.,（四）PCR的常见问题及处理措施,常见问题污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现S形曲线。污染的来源：来自其他测试样品的DNA来自试验材料如重组克隆的DNA外源DNA污染来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。,.,（三）PCR的常见问题及处理措施,如何减少污染实验室分区,.,酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。紫外线表面照射消除试剂、加样头中的DNA污染。对短PCR产物效果不好以预防污染为主良好的实验室操作,.,三、荧光定量PCR,.,（一）荧光PCR定量的概念,以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对PCR起始模板量的定量。,.,（二）荧光定量PCR原理,染料染色SYBRGreenI溴乙锭(EthidiumBromide)探针标记TaqManTM分子信标(Molecularbeacons),.,TaqMan探针,.,（三）定量PCR的数学原理,PCR理论方程,N=N0 x(1+E)n,N:扩增数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数,.,指数期PCR定量方程才有效,.,PCR曲线,线性图谱,半对数图谱,.,起点定量与终点定量,起点定量,终点定量,“加进不同拷贝的膜板”,.,同一个样品重复96次,起点定量的优势,终点产物数量：误差太大,拐点产物数量：重现性好,起始DNA量，更具意义重现性好，误差小,.,起点定量的关键：CT值,CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数,CT值,半对数图谱,CT值,线性图谱,.,CT起始DNA浓度,当循环次数n=CT值时：,RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lgRs,即CT=-klgX0+b（线性方程）,Rn=RB+X0(1+E)nRs,.,CT值-X0作图,CT,X0,CT=-klogX0+b,.,四、PCR检测的临床应用,（一）标本采集要求,.,.,.,（二）结果分析、报告及解释1.定性PCR与定量PCR的比较2.定量PCR测定的临床意义3.定性PCR测定的临床意义4.定性和定量测定的结果报告及解释,.,1.定性PCR与定量PCR的比较,.,琼脂糖凝胶电泳,.,定量PCR扩增曲线图,.,2.定量PCR的临床意义,对致病微生物核酸含量进行定量检测弥补免疫检测的缺陷缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）对治疗过程进行药物疗效监测用于基因表达方面的研究,.,某患者HBV-DNA的PCR结果动态图,.,3、定性测定的临床应用诊断用于筛检耐药突变检测病毒基因型检测,GGAGGGAGAAAA,.,4.定性和定量测定的结果报告及解释,（1）定性阴性阳性（2）定量(以我科参考值为例)HBV-DNA100IU/ml(不同项目数值不同)大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。,.,大于107拷贝