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文档简介
第八章微生物的生长繁殖及其控制,目的和要求:本章主要使大家掌握微生物生长繁殖的规律,微生物生长的测定方法,及各种物理、化学因素对微生物生长的影响,有害微生物的控制方法,重点、难点:(1)单细胞微生物典型生长曲线的特征(2)温度、O2、pH对微生物生长的影响(3)控制有害微生物生长的方法有哪些,各自的特点。,一个微生物细胞,合适的外界条件,吸收营养物质,进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加,达到一定程度后就会发生繁殖,引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,第一节微生物纯培养的获得,一、获得纯培养的方法,液体稀释法,平板划线分离法,倾注平板法,平板涂布分离法,选择性培养分离法,单细胞(单孢子)分离法,第二节测定生长繁殖的方法,(一)测生长量(二)计繁殖数,一、测生长量一)、直接法1.测体积法;2.称干重法;二)、间接法1.比浊法:比浊管法;分光光度计法;2.生理指标法:测含N量;测含C量;其他。,分光光度计法,二、计繁殖数,一)、直接法比例计数法、血球计数板法、薄膜过滤染色镜检法薄膜过滤荧光镜检法二)、间接法(活菌计数法)平板菌落计数法、平板涂布法、薄膜过滤平皿计数法,1总细胞计数法,1)血球计数板法,薄膜过滤吖叮橙染色荧光镜检法,1)平皿菌落计数法(稀释倒平板法),2活细胞计数法,2)平皿菌落计数法(平板涂布法),3)薄膜过滤平皿计数法,微生物生长测定方法比较,测定细胞数目,测定物质量,比浊法快速简便,敏感度低,适于发酵液或液体中的快速总细胞数估计,但需事先标定,同步培养技术:即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了解单个细胞所发生的变化。同步生长的概念:在培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段,并都能同时分裂的生长方式同步培养的方法通常分为:诱导法和机械筛选法,一、微生物的个体生长和同步生长,第三节微生物的生长规律,获得同步生长的方法:,二、微生物的生长曲线,生长曲线(GrowthCurve):,把少量纯种单细胞微生物接种到一定量的液体培养基中,定时取样测定细胞数量,以培养时间为横坐标,以菌数的对数值为纵坐标作图,得到的一条反映微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。,做法:,1、单细胞微生物的典型生长曲线,一条典型的生长曲线一般可以分为延滞期,指数期,稳定期和衰亡期等四个生长时期,(1)延滞期(Lagphase):,将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立即增加,生长速率常数接近于零。,延滞期的特点:,分裂迟缓、代谢活跃,生长速率常数等于零细胞形态变大细胞内RNA尤其是rRNA含量高,原生质呈嗜碱性;合成代谢活跃,易产生诱导酶对外界不良条件反应敏感,延滞期出现的原因:,调整代谢,影响延滞期长短的因素:,菌种,菌龄,接种量,培养条件,种子损伤度,在生产实践中缩短延滞期的常用手段:,(1)通过遗传学方法改变菌种的遗传特性使延滞期缩短;,(2)利用对数生长期的细胞作为种子;,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;,(4)适当扩大接种量,指数生长期(Logphase):,又称对数期,是指在生长曲线中,细胞以几何级数速度分裂的一段时期,特点:生长速率常数最大,即代时最短;细胞内各种成分进行匀衡生长酶系活跃,代谢旺盛。细胞对理化因素较敏感。,在指数期中,有三个参数最为重要:1、繁殖代数N;2、生长速率常数R;3、代时G。,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度代时E.coli(大肠杆菌)肉汤3717minE.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes(产气肠细菌)肉汤或牛奶371618E.aerogenes组合372944B.Cereus(蜡状芽孢杆菌)肉汤3018B.thermophilus(嗜热芽孢杆菌)肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳杆菌)牛奶376687Streptococcuslactis(乳酸链球菌)牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi(伤寒沙门氏菌)肉汤3723.5Azotobacterchroococcum(褐球固氮菌)葡萄糖2534446Mycobacteriumtuberculosis(结核分枝杆菌)组合3779293Nitrobacteragilis(活跃硝化杆菌)组合271200,影响微生物指数期代时的因素:,1)菌种,不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同;,2)营养成分,在营养丰富的培养基中生长代时短,3)营养物浓度,影响微生物的生长速率和总生长量,凡是处于较低浓度范围内,可影响生长速率和菌体产量的营养物,就称为生长限制因子。,4)温度,影响微生物的生长速率,实践意义:是发酵生产上用作菌种的最佳菌龄;发酵工业上尽量延长该期,以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,稳定期(stationaryphase),又称:恒定期或最高生长期特点:培生长速率常数R0,正、负增长相等;菌体产量达到了最高点;细胞内开始积聚糖原、异染粒和脂肪等内含物;芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢;开始合成次生代谢产物,是最佳的菌体收获时期。,产生原因:1.营养物尤其是生长限制因子的耗尽2.营养物的比例失调,如碳氮比不合适;3.有害代谢废物的积累(酸、醇、毒素等)4.物化条件(pH、氧化还原势等)不合适;,延长稳定期采取的措施:补充营养物质取走代谢产物改善培养条件,衰亡期(Decline或Deathphase):,细菌死亡速率大于繁殖速率,死亡的细菌以对数方式增加。,特点:细胞以指数速率死亡细菌代谢活性降低细菌衰老并出现自溶细胞呈现多种形态,革兰氏染色有时呈假阴性,2、丝状微生物的群体生长,可分为三个阶段:1、停滞期2、快速生长期3、衰退期,三、微生物的连续培养,连续培养(continuousculture)又称开放培养(openculture)。目的:使微生物可长期保持在指数期平衡生长状态和稳定的生长速率上。方法:当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时,一方面以一定速度连续流进新鲜培养基,并立即搅拌均匀;另一方面,利用溢流的方式,以同样的流速不断流出培养物。结果:培养物达到动态平衡,形成微生物高速连续生长(continuousgrowth)。,控制连续培养的方法,恒浊连续培养,恒化连续培养,不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定,保持恒定的流速而调节限制营养因子的浓度,概念:根据培养器内微生物的密度(浊度),并借光电控制系统来控制培养液流速,以取得菌体密度高、生长速度恒定的连续培养装置。原理:通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌体浓度不变特点:基质过量,微生物始终以最高速率进行生长,并可在允许范围内控制不同的菌体密度;,1.连续培养技术恒浊培养,使用范围:用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物,如乳酸、乙醇等。,2.连续培养技术恒化连续培养,概念:通过控制某一营养物(生长限制因子)的浓度,使培养液的流速保持不变,并使微生物始终在低于最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。应用范围:实验室科学研究,恒浊器与恒化器的比较,连续发酵(continuousfermentation),连续培养在生产上的应用,相对于单批发酵而言。优点:高效,简化了操作自控:便于利用各种传感器及仪表进行自动控制;产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽,且使水、汽、电的负荷均衡合理。,缺点:菌种易于退化;易于遭到杂菌污染;营养物利用率低于单批培养。,微生物的高密度细胞培养一般是指在液体培养条件下细胞含量超过常规培养10倍以上的发酵技术。高密度细胞培养的方法:选取最佳培养基成分和各成分含量;补料;提高溶解氧的浓度;防止有害代谢产物(如乙酸)的生成;保持合适的pH,第四节影响微生物生长的主要因素,影响因素很多,主要的外界物理因素有:,氧,温度,pH值,一、温度,温度对微生物的影响具体表现在:影响酶活性影响细胞膜的流动性影响物质的溶解度,最适生长温度:某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。,同一微生物不同生理生化过程有不同的最适温度。如:青霉素发酵:(产量比30提高14.7%)302520250h5h40h125h165h,致死温度,致使微生物完全死亡的最低温度界限。(一般在生理盐水中,10分钟)多数细菌、酵母、霉菌和病毒:50-65;嗜热脂肪芽孢杆菌营养体:120以上;放线菌:76-80;芽孢:100以上,肉毒梭状芽孢杆菌:120-121。,根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌:好氧菌兼性厌氧菌:微好氧菌:耐氧厌氧菌:厌氧菌(专性)厌氧菌:,二、氧气对微生物生长的影响,一)好氧菌1、专性好氧菌(obligateorstrictaerobes)必须在较高氧分压的条件下才能生长,有完整的呼吸链,以分子氧作为最终氢受体,细胞含超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(catalase)。,2、兼性厌氧菌(facultativeanaerobes)在有氧或无氧条件下均能生长,但有氧情况下生长得更好;在有氧时靠呼吸产能,无氧时借发酵和无氧呼吸产能,细胞含SOD和H2O2酶。3、微好氧菌(microaerophilicbacteria)只能在较低氧分压下才能正常生长。也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。,4、耐氧菌(areotolerantanaerobes)一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌,即它们的生长不需要氧,分子氧对它也无毒害。它们不具有呼吸链仅依靠专性发酵和底物水平磷酸化获得能量,有SOD、过氧化物酶,无过氧化氢酶,乳酸菌。5、厌氧菌(anaerobes)分子氧对它们有毒害。靠发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化、甲烷发酵获得能量。缺乏SOD和细胞色素氧化酶,大多缺乏H2O2酶。,二)厌氧菌,氧毒害厌氧菌的机制:,生物体的针对措施:超氧化物歧化酶(superoxidedismutase-SOD)是其中之一。好氧、耐氧微生物的超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为毒性稍低的过氧化氢,过氧化氢酶再将过氧化氢转化为无毒的水。厌氧微生物因为没有超氧化物歧化酶,超氧阴离子自由基可造成其损害。,过氧化氢酶H2O+1/2O2SOD好氧菌2O2-+2HH2O2+O2好氧、耐氧微生物过氧化物酶2H2O耐氧菌NADH2NAD,好氧微生物兼性好氧微生物耐氧厌氧微生物厌氧微生物微好氧微生物,/(低水平),三、pH,不同微生物的生长pH存在最低、最高与最适3个数值(生长PH三基点)。,(一)嗜中性微生物生长的pH范围是pH5.58.0,最适生长pH近中性(pH7.0)。大多数细菌属于嗜中性微生物。(二)嗜酸性微生物最适生长pH在5.5以下生长的微生物称之为嗜酸性微生物。(三)嗜碱性微生物生长的pH范围是pH7.011.5,最适生长pH在8.0以上。,pH与微生物生长,同一微生物不同生长阶段、不同生理、生化过程有不同的最适pH。黑曲霉:菌体生长,2.5-6.5;产柠檬酸,2-2.5;合成草酸,7左右。pH影响微生物生长机制:(1)介质pH影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性;(2)介质pH影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力;(3)代谢中各种酶的活力,第四节微生物培养法概论,自学注意:亨盖特滚管技术厌氧手套箱厌氧罐现代实验室研究厌氧菌最有效的三大件技术,一个良好的微生物培养装置的基本条件是:按微生物的生长规律进行科学的设计,能在提供丰富而均匀营养物质的基础上,保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件(只有厌氧菌例外),此外,还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。,微生物培养技术发展的特点:,1、从少量到大规模培养;2、从浅层培养到厚层或深层(液体搅拌)培养;3、从以固体培养技术到以液体培养技术为主;4、从静止式液体培养到通气搅拌式的液体培养;5、从单批培养发展到连续培养、多级连续培养;6、从利用分散的微生物细胞到利用固定化细胞;,7、从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞;8、从利用野生型菌种到利用变异、“工程菌株”;9、从单菌发酵发展到混菌发酵;10、从低密度培养发展到高密度培养;11、从人工控制的发酵罐到自动化发酵罐。,常用微生物培养方法,好氧培养方法,1)固体好氧培养方法,琼脂斜面和琼脂平皿培养,香菇固体栽培床,液体好氧培养方法,恒温振荡培养箱,实验室小型全自动发酵罐,厌氧培养方法,微生物厌氧培养箱,根据控制作用的效果分类灭菌(sterilization):凡是能够杀死或消除材料或物体上全部微生物的方法;消毒(disinfection):能够杀死、消除或降低材料或物体上的病原微生物,使之不致引起疾病的方法;防腐(antisepsis):能够防止或抑制微生物生长,但不能杀死微生物群体的方法。化疗(chemotheraphy):利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖,以达到治疗该传染病的一种措施。根据控制作用原理、方式和方法分类物理控制方法化学控制方法两大类,第六节微生物生长的控制,一、物理控制方法,高温灭菌,干热灭菌:1500C1700C下处理1-2小时。适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点:可保持物品的干燥火焰灭菌(灼烧灭菌):常用于金属性接种工具、污染物品及实验材料等废弃物的处理。,1、干热灭菌法,湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。,2.湿热灭菌,在相同温度下,湿热的效力比干热灭菌好。,为什么?,热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强,热蒸汽比热空气穿透力强,蒸汽潜热大,当气体转变为液体时可放出大量热量,故可迅速提高灭菌物体的温度。,湿热灭菌的种类:煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌、巴氏消毒、实罐灭菌,热致死时间(thermaldeathtime):即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的最短时间。热死温度(thermaldeathtime):又称热死点,指在一定时间内(一般10min),杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。,衡量灭菌效果的指标,煮沸消毒:水,100处理15min以上。高压蒸汽灭菌(autoclave):,121,15-20min;115,15-35min;注意:要充分排尽空气再升至高温。,高压蒸汽灭菌锅,注意事项:排净冷空气;灭菌终了,缓慢降压;灭菌结束,趁热取出物品。,该法不是利用高压来杀死微生物,而是利用提高压力使水的沸点升高,以提高水蒸汽的温度,更加有效地杀灭微生物。,影响加压蒸汽灭菌效果的因素,1.灭菌物含菌量2.灭菌锅内空气排除程度3.灭菌对象pH4.灭菌对象体积5.加热与散热速度,高温对培养基的影响及其防止措施,高温对培养基的不利影响:会产生混浊或形成不溶性沉淀营养成分被破坏(葡萄糖生成酮糖);色泽加深(褐变如产生氨基糖等);改变培养基的pH值(通常下降0.2);形成有害物质,抑制微生物生长;消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂,巴氏消毒法(pasteurization):低温消毒法,一般在630C,30min或720C,15s。用于牛奶,啤酒,果酒,酱油等不能进行高温灭菌的液体。可杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等,同时又不损害营养与风味。,间隙灭菌法:用流通蒸汽反复多次处理的灭菌法。,低温抑菌:冷藏法、冷冻法干燥和高渗抑菌辐射杀菌:紫外光、电离辐射、某种条件下的强可见光、微波过滤除菌,化学控制方法主要是指利用各种化学药剂控制微生物生长的方法。,二、化学控制方法,抑菌剂(Bacteriostaticagent):抗微生物剂杀菌剂(Bactericide):溶菌剂(Bacteriolysis):消毒剂(Disinfectant)非选择性防腐剂(Antisepsis)抗微生物剂抗代谢药物有选择性抗生素中草药有效成分,评价化学药剂的效果和毒性的指标:最低抑制浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)半致死剂量(LD50)最低致死剂量(minimumlethaldose,MLD),消毒剂:可以抑制或杀灭微生物,但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。防腐剂是指那些可以抑制微生物生长,但对人体或动物体的毒性较低的化学试剂。用于食品、饮料、药品的防腐作用。
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