细菌计数-生长筛选诱变-第三节

1,第二章工业微生物基础,2,第三节微生物菌种的分离选育和保藏,微生物菌种是工业发酵生产的基本条件。发酵的产量、发酵原料的利用率、生产周期等均与菌种有关。,3,细菌生长（数量）测定方法,借助显微镜观察测定,优点：快速提问:有哪些缺点?缺点：不能区分细菌的死活另外主要的一种就是平板培养计数。,基础知识,4,1.涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml1cm2)*视野面积(cm2),5,2.计数器(血球计数板）测定法,0.1ml菌液,6,提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个125)*400/0.1ml=2880个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度；,7,3.比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5400万个/ml=2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,8,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问：如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,9,5、平板计数法,将待测样品制成菌悬液；菌悬液用10倍稀释法适当稀释；定量取稀释液（0.2ml）涂平板培养，根据平板上生长的菌落计数；特点：活菌计数，适用于单细胞微生物；要点：同一稀释度涂布三皿以上取平均值计数；每支移液管或枪头只能接触一个稀释度的菌液；,10,稀释涂平板法活菌计数,11,稀释涂平板法活菌计数,12,一、微生物菌种的分离,选育筛选与定向培育筛选“众里挑一”,定向培育“教育培训”,13,(1)采样,原理：微生物的生态特点优胜劣汰天然特殊区域采样例如筛选能降解石油的细菌？,收集长期被石油污染的土壤(天然选择性固体培养基），必有适应石油环境利用石油作为食物的细菌，将土壤样品在实验室用石油降解菌选择性培养基，对样品中的石油降解菌进行进一步的选择培养，筛选分离，富集，为下一步的驯化工作奠定基础。,14,（2）增殖培养,给予有利的培养条件，如特殊的碳源、pH值、温度。添加一些专性抑制剂，如在分离放线菌时，添加10%苯酚，以抑制霉菌和细菌的生长。,15,（3）纯种分离,划线法稀释法,16,稀释涂平板法活菌计数,17,驯化,选择性培养基（石油）浓度升高,（4）筛选,2,3、4,1,4,小考,中考,高考,18,有两种制备思路：,？,1）选择性？待选的细菌能优势生长,选择性培养基,19,投毒法,常用物质为染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱和抗生素。例如欲分离古细菌，培养基中通常加入青霉素（由于古细菌的细胞壁不同于普通细菌，因而不会被对破坏普通细菌细胞壁结构的青霉素杀死），古细菌就唯一分离并存活下来。,胆汁酸盐抑制革兰氏阳性菌提问：它能选择性生长那种细菌？革兰氏阴性细菌,毒选择性的抑制剂待选细菌有抗性,20,投其所好法,好营养、环境因子（1）专一性营养源培养法待选细菌专门需要的某种碳源或氮源例如筛选纤维素分解菌选用纤维素作为培养基中的唯一碳源；各类降解石化废水特殊有机物的细菌筛选通常是以这类有机物为培养基中的唯一碳源，将目的细菌富集筛选下来。,21,（2）理化因素控制法理化因素特殊的温度、氧气、pH、盐度等环境条件主要用于筛选极端环境微生物。如嗜盐、嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱等的细菌，同时也被用于选择性培养好氧或厌氧细菌。,嗜冷菌,嗜热菌,22,（1）渐变诱导法(休眠的酶基因复活+自然突变)方法：,待降解物通常为有机毒物或惰性物。,5,选择性培养基（待降解物，如石油）浓度升高,5,n,筛选与诱导驯化可以同时进行特点:操作简便，驯化的潜力有限，慢。,结果,二、诱变及基因工程育种,23,诱变剂：温度、紫外线、核辐射、酸、碱、化学诱变剂等等。,（2）突变诱变法,提问：哪些因素可以引起基因突变呢？,提问：基因突变的分子机制？DNA碱基丢失、增多、错配等点突变染色体畸变基因突变有这样几个特点。,24,A基因突变的特点,发生.随机性结果.无定向性基因突变在哪一个细菌中发生是随机的，突变基因的部位也是随机的。突变的发生没有固定的方向。频率.稀有性可.诱变性突变率（每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的机率）通常为10-510-10。十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变。人工诱变可提高10105倍,25,.可逆性修复成功.稳定性修复失败产生的变异性状是稳定的、可遗传的。利用基因突变的特点，可以通过人工诱变进行细菌的基因改造。,26,常用的诱变剂：紫外线、5溴尿嘧啶、亚硝酸、卟啶染料等。,诱变的步骤.制出发菌株的单细菌悬浮液提问：为什么？如何在整个过程中尽量使细菌分散呢？诱变剂与细菌充分接触；向细菌培养液中加入玻璃珠，并保持在诱变过程中始终进行振荡搅拌形成出发细菌的单细菌悬浮液；,B方法,27,.选择合适的诱变剂剂量进行诱变提问：为什么要有剂量限制呢？少,效率低;过高“是药三分毒”会造成细菌大量死亡。例如在进行细菌紫外诱变时，通常使用15或20W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液1530cm，照射1520min。.筛选突变出的高效菌提问：如何筛？选择性培养基:抑制不需要的性状：如抗性筛选、抗渗透压筛选；还需添加必需的营养，如缺陷型菌株的筛选。,28,综合评价,诱变法潜力要远大于诱导法，但操作复杂。在实际诱变中，往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体。最后这些突变体将会在实验室小试、中试的基础上被投放到生产实践中。,29,（3）基因重组法,不同个体基因重新组合A形式自发基因重组与人工基因重组自发基因重组a.真核生物为杂交；精卵细胞质融合过程中所有遗传物质的重组,b.原核生物为转化、转导、接合；部分遗传物质的转移和重组,30,.转化Transformation（引进）,供体细菌研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细菌并发生基因重新组合的方式。,受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状“转运同化”如：抗性质粒,引进,31,目前发现自然状态下许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中都也有转化现象。,32,.接合（合作）,.转导（间谍窃取）噬菌体细菌病毒通过噬菌体的携带而转移导入的基因重组现象称为转导。转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。,细菌有性生殖,33,B.人工基因重组遗传工程,遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。工程：类似工程设计那样有很高的预见性、精确性与严密性。,34,遗传工程的方法,遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平。所以，又可把它分为细胞工程和基因工程。细胞工程两个细胞原生质体融合,基因工程两个细胞DNA片段剪接拼接,狭义的讲，遗传工程就是基因工程。原理：限制性核酸内切酶,35,在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌,长出必然是重组成功的细菌,外源基因片段,36,例如：降解石油的工程细菌70年代美国生物学家查克捡巴蒂(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。石油成分复杂，是由饱和、不饱和、直链、支链、芳香烃类组成，不溶于水。而海水含盐量高，虽发现90多种微生物有不同程度降解烃类的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也较馒，查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中23的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。见下图。,37,基因工程方法看似简单，但在具体实施上有较大的难度。A.细菌的质粒本身容易丢失或转移B.质粒具有不相容性（只有在一定条件下，属于不同的不相容种群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中。）,38,三、原生质体融合,通过人为方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合,继而遗传重组,借以获得兼有双亲性状,遗传性稳定的融合子的过程。,39,主要步骤：1）选择亲本2）制备原生质体3）原生质体融合4）原生质体再生5）筛选,40,四、菌种保藏菌种衰退现象：形态、生长速度、代谢产物、致病性、抗逆性等复壮：通过分离纯化和测定，从衰退群体中筛选未退化的个体。,41,菌种衰退的防止：1）减少传代次数2）良好培养条件3）利用不易衰退的细胞传代4）菌种的有效保藏,42,保藏条件：低温、干燥、无氧、低营养、保护剂,43,工业上常用的菌种保藏方法,1、斜面冰箱保藏法