酶与蛋白质工程 第1章 蛋白质与蛋白质工程

.,第一讲蛋白质与蛋白质工程,蛋白质在生命活动中的重要作用,生物催化作用：酶运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白调节作用：如胰岛素、生长激素运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白能量转换蛋白：如细胞色素基因调节蛋白：如阻遏蛋白,蛋白质在机体内的生物学功能,蛋白质的基本结构单位氨基酸,氨基酸的基本结构和构型存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质经强酸水解之后可以得到20种氨基酸，并且均为L-氨基酸（除了甘氨酸），含不对称的-碳原子。它们之间的差别在于有不同的侧链基团R,氨基酸结构通式,或,除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性,含非极性侧链基团,含极性侧链基团,Ser,SThr,TCys,CPro,PAsn,NGln,Q,Gly,GAla,AVal,VLeu,LMet,MIle,I,含芳香基团,含碱性侧链基团（带正电荷）,Phe,F;Tyr,Y;Trp,W,Lys,K;Arg,R;His,H,含酸性侧链基团（带负电荷）,Asp,D;Glu,E,氨基酸的两性解离,氨基酸分子在水溶液中呈两性离子状态，在其等电点时，氨基酸所带的正、负电荷相等，净电荷为零。,pH=pI,pHpI,pHpI,带电荷为零,带电荷为正,带电荷为负,氨基酸的两性解离及等电点,(pK1),(pK2),氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度,等电点(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点氨基酸在等电点时的特点：1.净电荷数等于零，在电场中不移动；2.此时氨基酸的溶解度最小,蛋白质的化学结构和高级结构,肽键（peptidebond）和肽（peptide）,肽键：指蛋白质分子中，由一个氨基酸的-COOH和另一个氨基酸的-NH2之间脱水缩合而成的酰胺键，它是蛋白质结构中的主要共价键,肽：由肽键形成的化合物（二肽、三肽、寡肽、多肽）,+,-HOH,肽键,多肽（polypeptide）和多肽链（polypeptidechain）,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸序列，多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基(aminoacidresidue)上图为：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-异亮氨酸,（N-端）,（C-端）,肽键的结构特点氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转,肽平面/酰胺平面,肽平面由肽键周围的6个原子组成的刚性平面,由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转,肽平面,一个具有生物活性的蛋白质多肽链在一定条件下往往只有一种或很少的几种构象。主要是因为肽链结构的高度共振稳定性,蛋白质的一级结构,一级结构（primarystructure）：即蛋白质的化学结构，是指多肽链上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，也包括二硫键的数目,牛胰岛素的一级结构：51个氨基酸，A（21肽）、B（30肽）两条肽链，A链内一对S-S，A和B链间2对S-S,蛋白质结构,蛋白质顺序测定基本战略,一级结构测定的基本流程:,(1)拆分蛋白质分子的多肽链;(2)鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基;(3)用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段;(4)测定各肽段的氨基酸序列;(5)重建完整多肽链的一级结构;(6)确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置,拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基,拆分,N-末端和C-末端氨基酸残基的确定为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点,N端分析方法：,二硝基氟苯法(DNFB法),丹磺酰氯法(DNS法),丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质,苯异硫氰酸(酯)法(PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法),由于其连续反应特性，成为蛋白质序列分析仪的分析原理！,C末端分析方法,肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离,多肽链部分裂解成较小的片段化大为小，获得短肽段,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等,胃蛋白酶：在疏水性氨基酸处部分水解，最适反应pH为23,胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链(专一性较强，水解速度快),R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr,糜蛋白酶,重建完整多肽链的一级结构获得多肽链的完整序列,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序,测定各短肽段的氨基酸序列,测定二硫键的位置,分子进化,细胞色素c是由104个氨基酸组成的蛋白质比较50种不同的生物，发现35个是保守的凡与人类亲缘关系越远的生物，其氨基酸顺序与人类的差异越大,从细胞色素c的一级结构看生物进化,蛋白质的高级结构,一条或数条多肽链上所有原子和基团在三维空间上的排布，即构象（conformation）或空间结构蛋白质的高级结构由明显的结构层次一级结构是空间结构的基础,（1）非共价键氢键离子键范德瓦尔力疏水作用（2）S-S键,维持蛋白质空间结构中重要的化学键,蛋白质结构层次,蛋白质结构极其复杂，但具有明显的结构层次一级结构（多肽链上的氨基酸排列顺序）二级结构（多肽链主链骨架的局部空间结构）超二级结构（二级结构单位的集合体）结构域（多肽链上可以明显区分的球状区域）三级结构（多肽链上所有原子和基团的空间排布）四级结构（由球状亚基或分子缔合而成的集合体）,蛋白质的主要结构层次,二级结构,二级结构（secondarystructure）：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步的盘旋或折叠，形成的周期性构象，维系二级结构的力是氢键,二级结构主要形式有：-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲,-螺旋（-helix）,在角蛋白中最常见的构象，为右手螺旋。每圈螺旋3.6个氨基酸残基。侧链基团R在螺旋外侧。主链内部形成H-键，不涉及侧链R典型的-螺旋是3.613螺旋，一周螺旋3.6个氨基酸，跨越13个原子,卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemicalengineering),-角蛋白在烫发剂、湿热条件下头发中的二硫键和氢键打破，伸展转变为-构象，在定型剂作用下冷却干燥时，发芯结构重组并稳定这是因为-角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在-构象状态，此外-角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(-螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础,-折叠（-sheet）,平行结构,反平行结构,存在于丝心蛋白、角蛋白。呈平行的和反平行的比较伸展的构象。主链之间形成H键，侧链基团R交替地位于片层的上、下,-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象,-转角（-turn）,肽链1800的回折,无规卷曲（randomcoil）,两种主要类型的-转角,蛋白质的肽链中没有确定规律性的那部分肽段构象,超二级结构,超二级结构（supersecondarystructure）：在蛋白质中经常存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成有规则的二级结构集合体，超二级结构又称基序或模体（motif）,四种类型的超二级结构,结构域,结构域（domain）：在较大的蛋白质分子里，多肽链的空间折叠常常形成两个或多个近似球状的三维实体,它们之间连接松散,由-折叠、-螺旋形成的结构域,丙酮酸激酶的一个结构域,免疫球蛋白的一个结构域,三级结构,三级结构（tertiarystructure）：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步盘绕、折叠而成的具有特定肽链走向的紧密球状结构,或者说三级结构是指多肽链中所有原子和基团在三维空间的排布,肌红蛋白的三级结构及其结合的血红素亚基,三级结构的稳定主要靠非共价相互作用氨基酸亲水的基团倾向于分布在分子的表面，疏水的基团在分子的内部,四级结构,四级结构（quaternarystructure）：多个具有三级结构的多肽链（称亚基，Subunit）的聚合。或者说四级结构指亚基的种类、数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用,血红蛋白的四级结构,四级结构的稳定主要靠是疏水作用力，另外还有离子键、氢键、范德华引力等血红蛋白由4个亚基组成（22），每个亚基都与肌红蛋白非常相似,多肽、蛋白结构与功能的关系,一级结构与功能的关系,氨基酸组成变化改变其功能,一级结构改变引起分子病,基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，就会产生疾病，这种病称为分子病（moleculardisease）,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,-链N端氨基酸排列顺序12345678Hb-A(正常人)Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S(患者)Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,谷氨酸（极性）缬氨酸（非极性）,由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，导致病人窒息甚至死亡,镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息,正常细胞镰刀形细胞,它是最早认识的一种分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折，活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变，但病人可抗非洲疟疾,蛋白质的正确折叠与分子伴侣,多肽链的特定空间结构是其功能的保证肽链的正确折叠或亚基装配常常需要由一些蛋白质，例如热激蛋白（Heatshockprotein,Hsp）和某些酶的帮助，并且消耗ATP。但是，这样的蛋白质与酶并不加入到最终的折叠产物或装配复合物中。它们被称为分子伴侣（molecularchaperone）,疯牛病病牛的海绵样脑组织,疯牛病可能是由于朊蛋白（Pronprotein，PrP）的错误折叠引起,蛋白质的变构,变构作用（Allostericeffect）：效应剂（变构剂）作用于多亚基蛋白质后，导致其构象改变，继而引起其他亚基构象的改变，结果是蛋白质或酶生物活性的变化。可能是变构激活，也可能是变构抑制血红蛋白中的4个亚基与氧分子的亲和性不同。氧分子与血红蛋白的一个亚基结合后，引起其构象发生改变，这种变化在亚基之间传递，从而改变了其他亚基与氧的结合能力,(R)relaxedstate,(T)tensestate,血中氧分子的运送,静脉,动脉,环境氧高时Hb快速吸收氧分子,环境氧低时Hb迅速释放氧分子,释放氧分子后Hb变回Tstate,血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线,与肌红蛋白相比，血红蛋白的多个亚基之间的相互作用使其与氧的结合能力总体上削弱了（氧合曲线右移,由双曲线转变成S形曲线），但赋予其新的能力可以容易地将其结合的氧从氧分压高的组织（肺泡）向氧分压低的组织（肌肉）输送和转移,26SProteason-蛋白质的泛素化降解系统,2004NobelPrize:Ubiquitin,Ubiquitin(originally,ubiquitousimmunopoieticpolypeptide)wasfirstidentifiedin1975asan8.5-kDaproteinofunknownfunctionexpressedinalleukaryoticcells.Thebasicfunctionsofubiquitinandthecomponentsoftheubiquitinationpathwaywereelucidatedintheearly1980singroundbreakingworkperformedatFoxChaseCancerCenterbyAaronCiechanover,AvramHershko,andIrwinRoseforwhichtheNobelPrizeinChemistrywasawardedin2004,在高等植物中分布很广，根、茎、叶、花、果实、种子及胚芽鞘中都有，大多集中在生长旺盛部位,生长素-Auxin,Aux/IAA介导生长素信号途径,Whentoflower-tobeornottobe,何时开花-这是一个大问题,PhotoreceptorregulationofCO,蛋白质工程,蛋白质工程：以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造目的：对自然界存在的蛋白质加以改造，改造的目的是得到性能更符合人类要求的非天然蛋白质，以应用于工业、农业、医药卫生等各领域。同时，为分子生物学的基础理论研究提供强有力的新手段,蛋白质的改造通过改造它们的基因，再用基因工程的方法由工程菌种来生产新的蛋白质,需要三类知识：蛋白质空间结构测定通过X射线晶体结构分析等方法，对蛋白质分子的空间结构进行实验测定蛋白质分子设计通过理论方法，提出蛋白质改性的设计方案基因工程利用分子生物学技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白,当前蛋白质工程研究的热点：一方面是对具有明显生物学功能的天然蛋白质分子；另一