微生物检验 第十二章 真菌PPT课件

.,真菌,真菌,有细胞壁、典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。细胞质内有完整的细胞器。,.,原核细胞型微生物与真核细胞型微生物比较,.,Dimorphism（二相性真菌）,机体内寄生37,Unicellular,Multicellular,含动物蛋白培养基,yeast,沙保氏培养基25,普通培养基25,mold,.,.,真菌繁殖结构，一条菌丝可生成多个孢子,MorphologyofSpore,.,Categoriesofspore,sexualspore:,asexualspore,分生孢子,叶状孢子,孢子囊孢子,芽生孢子,厚膜孢子,关节孢子,大分生孢子,小分生孢子,.,.,厚膜孢子,.,关节孢子,.,.,标本,（1）皮肤的角质性物质（2）各种分泌物和排泄物（3）血液和体液（4）脓汁及渗出物,（1）采集的标本要适宜（2）在用药前采集标本（3）采集的标本量要足（4）严格无菌操作（5）采集的标本立即送检,注意,.,镜检真菌形态真菌抗原检测真菌分离培养与鉴定真菌核酸检测真菌毒素检测,实验室检验,.,癣病标本多用KOH湿片检查法,.,意义,判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。,直接镜检阳性表示：,有诊断意义。,看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种。,有假阳性结果。,局限性：,阴性结果不能排除真菌感染；,.,常用的染色方法,常用的染色方法有革兰染色、瑞氏染色、荧光染色，乳酸酚棉蓝染色、还有墨汁负染色等。对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。检测病人脑脊液标本中新生隐球菌，需作墨汁负染色后检查，背景为黑色，新生隐球菌和荚膜不着色,.,（二）、真菌抗原检测,白假丝酵母菌甘露聚糖抗原、隐球菌多糖荚膜抗原、组织胞浆菌循环多糖抗原常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫法,.,（三）、真菌的分离培养,真菌的培养特点：三低两高,真菌培养是目前准确鉴定真菌的可靠方法,平皿培养大试管培养玻片培养,.,菌落性质：酵母菌还是霉菌,菌落大小：病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大,致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。,菌落颜色病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；,菌落的性状是鉴别真菌的重要特征,.,真菌鉴定,1.糖(醇)类发酵试验,2.同化碳源试验,3.同化氮源试验,菌种鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是远远不够的，还需作生化反应，分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。,.,核酸检测,毒素的检测动物试验,.,1.多烯类抗生素，如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。2.吡咯类，包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。3.其他类如氟胞嘧啶。,抗真菌药物分类-化学结构分类,.,临床标本,直接检查,检测抗原,直接镜检,固定标本染色,墨汁负染色法,KOH法,毛发指甲皮屑,脑脊液,病理检查,.,小结,真菌的致病性,真菌的基本特性：菌丝、孢子、培养特性,标本采集注意事项,常用的检查方法：显微镜检查、分离培养、生化实验,.,思考题：,1.简述真菌的致病性特点。,2.真菌标本采集是有哪些注意事项？,3.形态学检查和培养在真菌检查中的意义。,.,（一）掌握毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子丝菌生物学特性、微生物学检验方法及鉴定。（二）熟悉浅部真菌感染的种类,目的要求,.,皮下组织感染真菌,毛癣菌属,表皮癣菌属,小孢子菌属,表面感染真菌,皮肤癣真菌,糠秕马拉色菌,着色真菌,孢子丝菌,.,位置：寄居于人体皮肤和毛干的最表层。因不接触组织细胞，很少引起宿主细胞反应。嗜脂性酵母样菌代表：秕糠马拉色菌(Malasseziafurfur)症状：皮肤表面出现花斑癣（汗斑）,.,微生物检验,1直接显微镜检查可采用透明胶带粘贴取材法，将透明胶带直接贴于皮肤表面，数分钟后揭下，直接贴于载玻片上镜检或经棉蓝染色或革兰染色后镜检。可见孢子和菌丝。孢子为圆形或卵形，厚壁，芽颈较宽，常成簇分布；菌丝粗短，呈腊肠样。,2分离培养与鉴定,.,毛癣菌属,毛癣菌属（Trichophyton）属半知菌亚门丝孢菌目丛梗孢菌科，有20余种，其中14种能引起人和动物的感染。临床上常见的有红色毛癣菌(trichophytonrubrum)须癣毛癣菌(T.mentagrophytes,又称石膏样毛癣菌)许兰毛癣菌(T.schoenleinii,又称黄癣菌)紫色毛癣菌（T.violaceum）断发毛癣菌（T.tonsurans）,.,毛癣菌：菌落灰白、红、橙或棕色,表面呈绒毛状、粉粒状或蜡样。大分生孢子细长棒状薄壁。菌丝有螺旋状、球拍状、鹿角状和结节状,.,微生物检验,1标本采集采集新发生的皮肤损害边缘皮屑；指甲近尖端下面甲屑；拔取无光泽病发。,2直接显微镜检查皮屑10%KOH液；指甲25%KOH/25%NaOH处理镜检可见透明、有隔，常有分支的菌丝及成链的关节孢子。,.,皮肤癣菌感染的毛发,.,三.分离培养标本70%乙醇或在青、链霉素混合液内处理5min生理盐水洗3次接种沙氏琼脂斜面25培养观察菌落特征。四.其他鉴定试验毛发穿孔试验脲酶试验特殊营养需要试验,.,毛发穿孔试验,将头发发剪成lcm长，置于已加入25ml蒸馏水和23滴10酵母浸膏液的平皿内，高压灭菌。将待检皮肤真菌接种于平皿内，置25孵育四周，每周检查一次，每次取数根毛发置载玻片上，经乳酚棉蓝染色后，置低倍镜下观察。若毛发有裂口或陷凹者为阳性，否则为阴性。,.,药物敏感试验,对灰黄霉素、伊曲康唑等药物敏感。,.,表皮癣菌属,表皮癣菌属（Epidermophyton）目前只有一个种，即絮状表皮癣菌（E.floccosum）,能引起人类感染。絮状表皮癣菌是一种常见的皮肤癣菌，可引起皮肤感染如股癣、足癣、体癣、手癣和甲癣。,.,絮状表皮癣菌生物学性状,皮屑和甲屑经+10%KOH液消化镜检可见分枝断裂的有隔菌丝，少见孢子培养后，菌落初为白色鹅毛状，以后转变为黄色粉末状。镜下可见球拍状菌丝、卵圆形或巨大棒状薄壁大分生孢子，无小分生孢子，在陈旧培养物中可见厚膜孢子。,.,表皮癣菌：菌落初为白色鹅毛状,以后变为黄绿色粉末状。粗棒状薄壁大分生孢子。菌丝球拍状,.,小孢子菌属,我国常见的有铁锈色小孢子菌、石膏样小孢子菌和狗小孢子菌等。小孢子菌属感染皮肤和毛发，很少感染甲。,.,小孢子菌生物学特性,皮屑和毛发+10%KOH处理镜检，皮屑中有分枝断裂菌丝，在毛发中呈现小孢子镶嵌的鞘包裹着发干。在沙氏培养基中可见白色、棕黄色或黄褐色、粉末或绒毛状菌落。镜下可见梳状、球拍状或结节状菌丝，卵圆形小分生孢子、厚壁梭形（纺锤形）大分生孢子。,.,小孢子癣菌：菌落为灰色、橘红色或棕黄色，厚壁大分生孢子，菌丝有结节状、梳状和球拍状,.,.,.,毛癣菌属,.,表皮癣菌属,.,小孢子癣菌属,.,皮下组织真菌感染,主要有着色真菌和孢子丝菌着色真菌感染发生在暴露部位，称着色真菌病。卡氏枝孢霉和裴氏着色芽生菌。申克孢子丝菌，属腐生性真菌，常因外伤接触带菌的花草等引起感染。此菌可引起孢子丝菌下疳。此菌也可引起深部感染。是一种二相性真菌。,.,着色真菌,分生孢子：树枝型、剑顶型、花瓶型：,.,.,多发生四肢暴露部位，开始为小丘疹，表面干燥或湿润，有鳞屑或鳞痂，逐渐形成斑块结节，呈疣状增殖。,.,直接显微镜检查：单个或成群厚壁孢子，有横隔或中间十字分隔。,培养：沙氏培养基，生长缓慢，菌落从灰黑色至黑色，有气生菌丝。菌落涂片镜检可见三种类型的分生孢子，有鉴定价值。,生化反应：不能水解淀粉，不凝固牛奶，能同化硝酸盐，需维生素B1。,对5-FC、伊曲康唑、氟康唑敏感，易产生耐药性,.,孢子丝菌,申克孢子丝菌,传染源：人和动物,传播途径：经破损皮肤接触感染。,二相性真菌。,.,微生物检验：,(1)直接显微镜检查：卵圆形的孢子。,.,(2)、分离培养与鉴定：将标本接种于沙氏培养基上25培养，2-3d开始生长，初为白色湿润的酵母型菌落，以后变为淡咖啡色至深褐色。37培养2-3d，可形成乳白色或淡褐色酵母型菌落。,（3）、对碘化钾、伊曲康唑、特比萘芬等药物敏感。,.,脚气,脚气是一种常见的真菌感染性皮肤病。多见于趾间,足底及足缘,有深在性水疱,糜烂及鳞屑,伴有瘙痒等症状.多见于成人,夏秋重,冬春轻,足多汗及常穿胶鞋者易患本病主要致病菌为红色毛癣菌、石膏样毛癣菌和絮状表皮癣菌。,.,医学上通常将脚气分三型：糜烂型、水疱型、角化型本病是由皮肤癣菌所引起的。足部多汗潮湿或鞋袜不通气等都可诱发本病。皮肤癣菌常通过污染的澡堂、游泳池边的地板、浴巾、公用拖鞋、洗脚盆而传染。,.,预防,1要保持脚的清洁干燥，勤换鞋袜，鞋子要通气良好。2不要用别人的拖鞋、浴巾、擦布等，不要在澡堂、游泳池旁的污水中行走。3公用澡堂、游泳池要做到污水经常处理，以防相互传染。,.,治疗,灰黄霉素、伊曲康唑派瑞松:曲安奈德益康唑乳膏达克宁:硝酸咪康唑软膏,.,第三十章深部感染真菌,.,（一）掌握深部感染真菌概念、分类、检验程序；掌握假丝酵母、隐球菌、卡氏肺孢菌微生物学特性、检验方法及鉴定要点。（二）熟悉荚膜组织胞浆菌孢子鉴别要点。（三）了解抗真菌药物分类及临床应用。,目的要求,.,（一）假丝酵母菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（二）隐球菌属；分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（三）曲霉菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（四）组织胞浆菌属：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。（五）卡氏肺孢菌：分类、临床意义、生物学特性、微生物学检验。,教学内容,.,DEFINITION,是指能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌，主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等。组织胞浆菌为二相性真菌，假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌和卡氏肺孢菌等为条件致病性真菌，只有在一定条件下才引起机体致病。,.,第一节假丝酵母菌属,假丝酵母菌（Candida），俗称念珠菌，生物学分类为半知菌亚门、半知菌纲、隐球菌目、假丝酵母菌属。本属菌有81个种，其中有11种对人有致病性，其中白假丝酵母菌最为常见。,.,(一)白假丝酵母菌,.,圆形或卵圆形，直径3-6m。革兰阳性，着色不均匀。出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝，在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。,MicrobiologyCharacteristics,.,将标本接种在沙氏培养基上，25或37培养1d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。,.,1)直接显微镜检查：取脓汁、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜见到革兰阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。2)抗原检测：取病人血清作ELISA、免疫印迹法等检测白假丝酵母菌抗原。3)核酸检测：用PCR法将白假丝酵母菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏性和特异性。,MicrobiologyExamination,.,将标本接种在沙氏培养基上，25或37培养1d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。,.,鉴定,1)芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.20.5m|血清中，37孵育1.5h观察有无芽管形成。白假丝酵母菌可形成芽管，其他假丝酵母菌不形成芽管。,.,将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基25孵育1-2d后，白假丝酵母菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。,2)厚膜孢子形成试验：,.,3)糖同化或发酵试验,商品化的产色培养基可快速鉴定白假丝酵母菌和其他假丝酵母菌。,.,(4)药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC等药物敏感，但对5-FC极易产生耐药性。(5)抗体检测：可用ELlSA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便。也可用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试验等检测血清中抗白假丝酵母菌抗体。(6)动物试验：将假丝酵母菌悬液注射1ml于家兔耳静脉或注射0.2ml于小白鼠尾静脉，观察5-7天，有无脏器小脓肿。,.,.,(二)热带假丝酵母菌,广泛分布于自然界，在人体表和外界相通的腔道中也存在。热带假丝酵母菌可引起皮肤、粘膜和内脏假丝酵母菌病。它除可在粘膜细胞上增殖引起感染外，其产生的毒素可引起过敏反应及产生的水解酶类引起组织损伤。,.,微生物检验,(1)直接显微镜检查：将标本作涂片革兰染色后镜检，观察+假丝酵母菌。(2)分离培养与鉴定：将标本接种在沙氏培养基上形成色暗而干燥的菌落,取菌落作TZC反应。,.,.,TZC反应,即在葡萄糖蛋白胨琼脂内加入005gL氯化三苯基四氮唑(TZC)，热带假丝酵母菌在此培养基上生长后使培养基变为深红色或紫色，而白假丝酵母菌不使培养基变色(淡红)。,.,案例分析,主诉：患白血病女童，10岁，发热2天。病史：病儿既往健康，1年前被诊断为白血病，经化疗后有缓解。入院前1个月开始出现进行性疲乏，体重减轻，骨髓象呈现50%未成熟细胞。曾给予化疗，并使用甾醇类药物，2天前体温升至39，无特异性定位体征。查体：T39，BP100/60mmHg，P100次/分，R20次/分，病人消瘦，呈慢性病面容。皮肤：苍白，有几处瘀斑，未见瘀点及黄疸；肺部：无异常。实验室检查：血：红细胞压积20%，WBC：600；分类：杆状核30%，淋巴细胞55%，单核细胞5%。尿无异常。病程记录：病人静脉注射替卡西林(ticarcillin)、奈夫西林(nafcillin)和妥布霉素(tobramycin)。入院后2天仍持续发热，第3天病人自诉左眼痛，视力模糊，眼底检查，在黄斑周边区域有白色、絮状病变。自诉喉痛，检查发现咽后壁有几处白色、粘附的斑块。,.,问题：1.你将采集何种标本做培养?2.根据上述结果，最有可能是哪一类的病原体?3.第四天血培养有卵圆形、无荚膜、革兰阳性病原体生长，体积是葡萄球菌的23倍，某些细胞有出芽。4.你如何鉴别该病原体的不同种类?5.该病原菌的自然定居部位是什么?,.,第二节隐球菌属,广泛分布于自然界，也存在于人体表、口腔和肠道中，鸽粪中大量存在。人因吸入鸽粪污染的空气而感染，特别是免疫功能低下者主要引起肺脑的急性或亚急性或慢性感染,.,形态：圆形，有肥厚荚膜，出芽繁殖，不形成假菌丝染色：墨汁负染培养特性：沙保或血琼脂培养基，25和37酵母型，表面黏稠、浑浊，乳白色菌落生化特性：分解尿素荚膜多糖抗原：AD4个血清型，我国约70%属A型,MicrobiologyCharacteristics,.,新生隐球菌（墨汁负染色）,.,新生隐球菌菌落,.,微生物检验,1、标本直接镜检（1）脑脊液作墨汁负染色(2)抗原检测(3)核酸检测,2、分离培养,病原性隐球菌在25和37生长，而非病原性隐球菌在37时不生长。培养25d后观察菌落形态特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。,.,3、鉴定,1）酚氧化酶试验：接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经培养，呈棕黑色菌落。2）脲酶试验：培养基可由黄色变粉红色，而白假丝酵母菌为阴性。3）糖同化及发酵试验：非致病性隐球菌不能同化肌醇。,4、药敏,对两性霉素B、5-FC、氟康唑等敏感，临床应用时常联合应用。,.,第三节曲霉菌,曲霉菌是条件致病菌，人体对其有极强免疫力，只有在人体免疫功能降低时才能致病。曲霉可引起呼吸系统曲霉病；全身性曲霉病；曲霉可产生毒素引起机体食物中毒；致癌作用。,.,.,直接显微镜检查取痰液等被检材料涂于载玻片上，在镜下可见分枝的菌丝、较粗的分生孢子头，顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小梗，小梗上有许多小分生孢子。抗原检测、抗体检测、药敏试验、皮肤试验。分离培养与鉴定：标本接种沙氏琼脂，室温培养后菌落形成快，呈毛状，一般为黄绿色。将菌落涂片镜检可见特征性的分子孢子头和足细胞。根据不同的曲霉的形态和菌落特征确定菌种。,.,曲霉结构图,.,.,曲霉菌,返回,.,烟曲霉菌落,烟曲霉,光镜X400,.,黄曲霉菌落,黄曲霉,光镜X200,.,黑曲霉菌落,黑曲霉,光镜X200,.,土曲霉菌落,土曲霉，光镜X200,.,构巢曲霉菌落,构巢曲霉,光镜X400,.,杂色曲霉菌落,杂色曲霉,光镜X400,返回,.,第四节组织胞浆菌属,有两个种：荚膜组织胞浆菌、组织孢浆菌的杜波变种。本菌传染性极大，主要侵犯网状内皮系统，有时也可由血行播散而侵犯全身各脏器。,.,MicrobiologyCharacteristics,组织胞浆菌是一种双相型真菌，在25培养时呈典型菌丝体，在37培养时为酵母型，位于细胞内或外。,荚膜组织胞浆菌：孢子卵圆形，2-4m，芽生孢子，一端较尖，芽颈较细，有荚膜。组织孢浆菌的杜波变种：孢子卵圆形，12-15m，薄壁的芽生孢子,.,微生物检验,1.直接显微镜检查应涂片染色后检查。痰液等标本：涂片后先用甲醇固定10min，再用姬姆萨染色镜检。皮损、脓液等标本：用20%KOH涂片后镜检2.抗原检测、药物敏感试验、抗体检测3.分离培养与鉴定标本含抗生素的沙氏培养基25培养，生长缓慢，有时需46周才开始生长，逐渐形成白色至棕色绒毛状菌落。,.,转种于血琼脂培养基上，37培养，很快形成酵母型菌落。培养物显微镜特征：25沙氏培养，可以发现特征性的大分生孢子，但初代培养不典型，继代培养可有典型大分生孢子。鉴定：取可疑菌落涂片染色镜检，并作脲酶试验和明胶液化试验。,.,荚膜组织胞浆菌菌落为棉絮状，镜检可见细长有隔菌丝，菌丝侧面或孢子柄上长有特殊的圆形大分生孢子，厚壁，四周有棘突，排列如齿轮。血液标本油镜下镜检可见在中性粒细胞或单核细胞中有卵圆形或圆形的酵母细胞,.,第五节卡氏肺孢菌,卡氏肺孢菌可寄生于多种动物，也可寄生于健康人体。广泛分布于自然界，如土壤和水等。卡氏肺孢菌病的传播途径主要是空气传播，在健康人体内，多为无症状的隐性感染。当宿主免疫力下降，如长期使用免疫抑制剂、器官移植、肿瘤、艾滋病等，潜伏的卡氏肺孢菌在病人肺内大量繁殖扩散，使肺泡上皮细胞受损，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌性肺炎（PCP）。,.,直接显微镜检查从病人痰液、支气管肺泡灌洗液或肺活检组织中检查PC是确诊本病的重要依据。常用的染色方法有姬姆萨染色、果氏环六亚甲基四胺银染色（GMS）和亚甲胺蓝染色。可以检出包囊和滋养体两种形态。抗原检测，核酸检测，抗体检测等。,.,毛霉目真菌,毛霉目真菌属于接合菌门、接合菌纲，有7个科，主要是毛霉科。本病是一种发病急，进展快、病死率极高的系统性条件致病性真菌感染。,.,毛霉目真菌,毛霉科,毛霉目真菌有无隔菌丝，在一些陈旧培养基中偶见有隔菌丝。形态可见匍匐丝和假根。,.,.,毛霉目真菌微生物检验,直接镜检临床标本20%KOH湿片，直接镜检可见折光性强的粗大