Lowry’s法(Folin-酚试剂法)测定蛋白含量

Lowrys法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量,DeterminationofproteincontentbyLowrysmethod,怎样测定血清中蛋白质的含量,蛋白质含量测定的常用方法比较,选择测定方法时应考虑,1、实验对测定所要求的灵敏度和精确度；2、蛋白质的性质；3、溶液中存在的干扰物质；4、测定所花费的时间等。,Lowrys法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量,DeterminationofproteincontentbyLowrysmethod,实验目的,1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。,原理,1921年，Folin首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。,原理,第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。,原理,第二步：Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr)，故有此显色反应。即蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。,在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。,原理,样品,健康人血清,试剂,1、牛血清白蛋白标准液（200g/ml）2、碱性硫酸铜溶液（当日有效）3、Folin-酚试剂,仪器和器材,1、V-1100分光光度计2、恒温水浴箱3、试管6支、试管架4、加样枪、加样枪架5、坐标纸,操作,各管混匀，室温放置10min。向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL,2s内迅速混匀！40放置10min。冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。,注意事项,Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。,注意事项,因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mLFolin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mLFolin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。,蛋白样品,碱性铜试剂,混匀，放10min,加酚试剂,2s混匀,水浴10min,放至室温,比色,数据处理,绘制标准曲线步骤,1、选择合适的坐标纸2、画坐标轴3、根据测得的数据描点4、连线5、求实验结果,绘制标准曲线,以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。,绘制标准曲线,根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。,计算,根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(g/ml)。血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度2300,本方法的特点：,优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。2.操作简单，不需特殊仪器设备。缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间2.标准曲线也不是严格的直线形式3.专一性较差，干扰物质较多。,复习思考题,1、试述Folin-酚试剂法的优点？2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？请将答案附在实验报告上！,V-1100分光光度计操作步骤,开机，预热30分钟转动波长旋钮，调所需波长。按键切换到T档将黑体放入光路中，合上盖，按键校零开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖，按键切换到A档拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上