《生物化学简明教程》第四版-第二章蛋白质.ppt

第2章,蛋白质(Protein),蛋白质的分类,蛋白质的组成单位-氨基酸,肽,蛋白质的结构,蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的性质与分离、分析技术,内容提要,是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子。,纤维状,球状,蛋白质(Protein),蛋白质的生物学作用,蛋白质是生物体的重要组成成分蛋白质具有重要的生物学功能1）作为生物催化剂（酶）2）物质的转运和储存3）运动与支持作用4）免疫保护作用5）代谢调节作用6）参与细胞间信息传递氧化供能,蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,2.1.1依据蛋白质的形状分类1）球状蛋白质：（globularprotein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2）纤维状蛋白质(fibrousprotein)分子构象类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。3）膜蛋白质,2.1蛋白质的分类,2.1.2依据蛋白质的组成分类,1.简单蛋白(simpleprotein)：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,（1）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。（2）糖蛋白与蛋白聚糖：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。糖与蛋白质的结合方式：O连接和N连接（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。（4）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。（5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,2.结合蛋白(conjugatedprotein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,2.1.3按功能分类,酶调节蛋白贮存蛋白转运蛋白质运动蛋白防御蛋白和毒蛋白受体蛋白支架蛋白结构蛋白异常功能,2.2蛋白质的组成单位-氨基酸,氨基酸（aminoacid)是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸组成。,2.2.1氨基酸的结构通式,氨基酸的结构式书写,20种常见氨基酸的名称和结构式,甘氨酸(a-氨基乙酸)Glycine,丙氨酸(a-氨基丙酸)Alanine,亮氨酸(-甲基-a-氨基戊酸)*Leucine,异亮氨酸(-甲基-a-氨基戊酸)*Isoleucine,缬氨酸(b-甲基-a-氨基丁酸)*Valine,脯氨酸(a-四氢吡咯甲酸)Proline,苯丙氨酸(b-苯基-a-氨基丙酸)*Phenylalanine,蛋(甲硫)氨酸(a-氨基-甲硫基戊酸)*Methionine,色氨酸a-氨基-(3-吲哚基)丙酸*Tryptophan,丝氨酸(a-氨基-羟基丙酸)Serine,谷氨酰胺(a-氨基戊酰胺酸)Glutamine,天冬酰胺(a-氨基丁酰胺酸)Asparagine,苏氨酸(a-氨基-b-羟基丁酸)*Threonine,半胱氨酸(a-氨基-b-巯基丙酸)Cysteine,酪氨酸(a-氨基-对羟苯基丙酸)Tyrosine,天冬氨酸(a-氨基丁二酸)Asparticacid,谷氨酸(a-氨基戊二酸)Glutamicacid,赖氨酸(a,w-二氨基己酸)*Lysine,精氨酸(a-氨基-d-胍基戊酸)Arginine,组氨酸a-氨基-b-(4-咪唑基)丙酸Histidine,20种标准氨基酸,蛋白质的元素组成：,C（5055%）、H（68%）、O（2023%）、N（1518%）、S（04%）、,Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等,蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量蛋白氮6.25,6.2516的倒数，每测定g氮相当于6.25g的蛋白质。也就是1g氮所代表的蛋白质量（克数）,蛋白质含量的测定（自学）,凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。除了上法外，还有双缩脲法，Folin酚，考马斯亮兰G250比色法等,总结,从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：(1)与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性，左旋（-）或右旋（+）B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,2.2.2氨基酸的分类,1.根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro,2.根据R的极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu（2）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,总结,属于芳香族氨基酸的是：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe属于亚氨基酸的是：脯氨酸Pro含硫氨基酸包括：半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly能形成二硫键的氨基酸是:半胱氨酸Cys含二羧基一氨基的氨基酸有:谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,半胱氨酸,胱氨酸,几种特殊氨基酸,这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的,几种特殊氨基酸,2.2.3氨基酸的重要理化性质,一般物理性质:氨基酸一般有味（无味、甜、苦、鲜等）一般均溶于水，溶于酸、碱中；不溶于有机溶剂。高熔点（200以上）,氨基酸的旋光性及立体异构除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性左旋（-）或右旋（+），比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,氨基酸的光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(pIaa“-”aa向正极移动pHpIaa“+”aa向负极移动pH=pIaa“0”aa不移动溶液的pH偏离pI越远，氨基酸带净电荷越多，在电场中越容易分离。利用不同的氨基酸在同一pH下所带电荷不同而分离，如用阴离子交换树脂柱层析分离氨基酸。等电点时,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。,自测,丙氨酸Ala的pI6.02，在pH7时，在电场中向（?）极移动。,(2)氨基酸的化学性质,氨基酸在溶液状态时,存在的平衡,1）与茚三酮的反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,脯氨酸与茚三酮反应的产物：,N+,黄色化合物,反应要点与应用,A.该反应由-NH2与-COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.用于氨基酸的定性、定量分析该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值测定范围：0.550g/mlD.脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）,2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,A.为-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。,应用,氨基酸定量分析-氨基酸的甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）简单快速，一般用于测定蛋白质的水解或合成的速度.,3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,弱碱性,DNP-氨基酸（黄色）,A.为-NH2的反应B.氨基酸-NH2的一个H原子，在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成黄色的2,4二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸，稳定）,应用,鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸此反应首先由Sanger应用测定蛋白质中氨基酸的排序，确定了胰岛素的一级结构5二甲氨基萘磺酰氯（DNSCl，又称丹磺酰氯）可以代替DNFB试剂测定蛋白质的N端氨基酸,肽链氨基末端残基的检测（Sanger法）,黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定,二甲氨基萘磺酰氯的简称丹磺酰氯可以取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,与5-二甲氨基萘磺酰氯的反应,（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,反应特点及应用,为-NH2的反应由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又称Edman降解法,此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,5）与亚硝酸的反应,NH2CHCOOH+HNO2R-CH-COOH+N2ROH+H2O应用：在标准条件下测定生成氮气的体积，可计算氨基酸的量，称为范斯莱克法。,6）与荧光胺反应,氨基酸与荧光胺反应生成具有荧光的产物，是-NH2的反应用于氨基酸定量分析根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）（激发波长x=390nm，发射波长m=475nm）。,荧光胺,硫代硝基苯甲酸(412nm),应用:-SH的反应,测定样品中游离-SH的含量,7）与5,5-双硫基-双（2-)硝基苯甲酸反应,2.3肽,2.3.1肽的结构一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物称为肽。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。,多肽（链）：多个氨基酸残基之间以肽键连接起来的链状化合物叫多肽或多肽链。氨基酸残基：,N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,肽链写法：,肽键的特点,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子（C1、C、O、N、H、C2）被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,生物活性肽（biologicalactivepeptide,BAP）是能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性的寡肽和多肽的总称。,2.3.2生物活性肽的功能,（1）谷光甘肽（GSH）,2GSH,GSSG,分子中具有一个由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基脱水缩合的-肽键含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。,谷光甘肽的作用,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,氧化型谷胱甘肽,举例,（2）催产素和升压素,（3）促肾上腺皮质激素（ACTH）,39肽，活性部位为第410位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。,（4）脑肽,脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。,Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。,（5）胰高血糖素由胰岛-细胞分泌（-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调节维持血糖浓度。,（6）胃肠道活性肽,2.4蛋白质的结构,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列,在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象,conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。,2.4.1蛋白质的一级结构（化学结构）,蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的序列，也包括二硫键的位置。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键主要指肽键（peptidebond）和二硫键（disulfidebond）,牛胰岛素的化学结构,2.4.2蛋白质的空间结构（构象、高级结构）,构象是蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。,研究蛋白质构象的方法,一X射线衍射法：二研究溶液中蛋白质构象的光谱方法：1紫外差光谱2荧光和荧光偏振3圆二色性4核磁共振（NMR）,共价键,次级键,化学键,肽键,一级结构,氢键,二硫键,二、三、四级结构,疏水作用,盐键,范德华力,三、四级结构,3.稳定蛋白质空间结构的作用力,（2）蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键：氢键,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleatedsheet)-转角(-turn)无规卷曲(randomcoil),1）-螺旋（-helix）Pauling和Corey于1951年提出,是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象,结构特征螺旋的每圈有3.6个氨基酸残基，每个氨基酸残基的高度为0.15nm，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100，螺旋直径0.6nm。（2）每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键，氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。,（要点：单链，右旋，一圈3.6残基，上升0.54nm维系力：氢键，且全部平行，R基指向外侧）,结构特征,螺旋的帽化,-螺旋（-helix）结构特点,3.613螺旋(ns),此外还有：310，4.416,(3)R侧链基团伸向螺旋的外侧。,(4）绝大多数天然蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。,结构特征：,影响-螺旋形成的因素,在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，-螺旋就不稳定。（Lys、Glu）在多肽链中只要出现pro，-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节。Gly的R基太小，难以形成-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成-螺旋。,2）-折叠结构（-pleatedsheet）,-折叠或-折叠片，也称-结构或-构象。-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直.氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面,-折叠有两种类型：一种为平行式，另一种为反平行式,N端在同一端。氨基酸残基的长度0.325nm,N端不在同一端。氨基酸残基的长度0.347nm,丝心蛋白的构象,丝心蛋白的性能丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性。具有0.7nm的周期。丝心蛋白(fibroin)是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白的构象丝心蛋白是典型的反平行折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。侧链交替地分布在折叠片的两侧。反平行折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要氢键连接，层间主要靠范德华力维系。,特点：肽链回折180度,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;(常见氨基酸：Pro,Gly)以主链间氢键维持稳定。弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,3）-转角（-turn）,4）凸起（-bugle）,在某些反平行的片层中，有一股折叠中有一个残基的肽键没有参与和相邻的折叠间的氢键，致使这一部位有所凸起，这一现象被称为凸起(bulge)。,插入的氨基酸残基,4）凸起（-bugle）,是一种小片的非重复性结构，能单独存在，但大多数经常作为反平行折叠片中的一种不规则情况而存在。凸起可认为是折叠股中额外插入的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在凸起折叠股上是两个残基，而另一侧的正常股上是一个残基。,5）无规卷曲或自由回转(randomcoil),指无规律的松散肽链结构在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。没有一定规律的松散肽链结构。常常是酶的活性部位。,（3）超二级结构和结构域,超二级结构(super-secondarystructures):是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。超二级结构的基本类型：、,X,超二级结构的基本类型：,模体,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,结构域(domain),是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。类型：-螺旋域；-折叠域；+域；/域；无规则卷曲+-回折域；无规则卷曲+-螺旋结构域等,（4）蛋白质的三级结构,多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，沿三维空间多方向卷曲，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构。是多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。,三级结构的特征,含多种二级结构单元，如螺旋、折叠等；有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。主要由疏水作用力维持实例：肌红蛋白,抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构,肌红蛋白的结构与功能,（1）功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点：a.一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17800道尔顿。b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段长度不等的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,辅基血红素Fe原子被称为原卟啉IX（9）的有机分子固定的，共称血红素（Heme），使血液呈红色。Fe有六个配位键，其中四个与卟啉的吡咯环的N原子相连。Fe2+称亚铁血红素，Fe3+为高铁血红素，只有Fe2+的蛋白才能结合氧,肌红蛋白的结构,氧与肌红蛋白的结合Fe2+与珠蛋白的93位（F8）His的咪唑基N相连；当形成氧合肌红蛋白（oxy-myoglobin）时，第6个配位键与氧结合；当成高铁肌红蛋白时，第6配位键被H2O分子占据；在氧结合一侧有一E7His氧结合部位形成空间位阻区,肌红蛋白的结构,（5）蛋白质的四级结构,四级结构是指由两个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为亚基(subunit)。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，亚基单独存在时无生物学活性。当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后，才有功能。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。,血红蛋白的结构,Hb分子近似球形；M.W.=65000Hb由四个亚基组成（二条亚基和二条亚基）；亚基（141aa）比亚基（146aa）短，但都比肌红蛋白链（153aa）短；这主要是因为末端H螺旋比较短；4个血红素分别位于四条多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处，并暴露于分子表面。Hb-和Hb-及Mb虽然三级结构相似，但其氨基酸序列却有很大的不同，约只有27个位置是相同的。,四级缔合在结构和功能上的优越性,1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3、提高基因编码的效率和经济性。4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6、适当降低溶液渗透压。7、具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节,蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列,蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠,Primarystructure,Secondarystructure,总结,蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构,蛋白质的四级结构是亚基的空间排列,Polypeptide(singlesubunitoftransthyretin),Transthyretin,withfouridenticalpolypeptidesubunits,Tertiarystructure,Quaternarystructure,总结,一个天然蛋白质在一定条件下，往往只有一种或很少几种构象。用一个蛋白质中各个原子范德华体积的总和，除以蛋白质所占体积即得装配密度，一般0.730.77.,2.5蛋白质结构与功能的关系,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。,2.5.1蛋白质一级结构与功能的关系,1.种属差异,蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。,举例胰岛素，细胞色素C,不同生物和人的细胞色素c中氨基酸组成的差异生物名称不同氨基酸数生物名称不同氨基酸数黑猩猩0恒河猴1猪、牛、羊10马12鸡13海龟15金枪鱼21小蝇25小麦35酵母44,从细胞色素c的一级结构看生物进化物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。,从细胞色素C的一级结构看生物进化,2.分子病A、分子病的概念：由于遗传基因的突变导致蛋白质分子结构的改变或某种蛋白质缺乏引起的疾病。B、例如：镰刀性贫血病,结论,蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证,2.5.2蛋白质构象与功能的关系,别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.例：血红蛋白的别构效应,免疫球蛋白,蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,2.6蛋白质的性质与分离、分析技术,2.6.1蛋白质的性质,（1）蛋白质相对分子量：在100001000000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,凝胶过滤法：分子量对数对洗脱体积作图，并用标准分子量蛋白质作对照，从图中就可以查得未知蛋白质的分子量。SDS-PAGE电泳法：为什么可用SDS-PAGE电泳来测定蛋白质的分子量？SDS的加入使蛋白质变性两者结合（1g蛋白质结合1.4gSDS）使之复合物带大量负电荷，远远掩盖了蛋白质本身所带电荷量和种类，因此在电场中由于与SDS结合全部带负电荷，因此迁移速率只与分子量有关，以分子量对迁移率作图成线性关系，以标准分子量蛋白质作对照，通过迁移率查得分子量。,凝胶过滤法,凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量,电泳,电泳,电泳migration,优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差）此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量,蛋白质相对分子量,最低分子量法：若某一蛋白质中某一特定成分含量为x%，且该组分只有一份，则最低分子量=原子量（分子量）100/x蛋白质或多肽链中aa残基的平均分子量为110,用蛋白质分子量除以110，可粗略估计出其aa残基数，在解题时常常遇到这一常数。,（2）蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)调节溶液的pH，使蛋白质所带的正、负电荷相等，即成为兼性离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。,1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。,2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。,电泳,（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。,2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,（3）蛋白质的变性(denaturation),概念：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的本质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,变性蛋白质的特点,失去生物活性溶解度减小粘度加大，结晶能力减弱容易被酶水解消化变性的分类：可逆变性：例如，把经过短时间煮沸的胰蛋白酶冷却，可以恢复天然胰蛋白酶的性质(如结晶性、活性等)。不可逆变性：例如，煮熟的鸡蛋,变性应用,变性在医学上有很重要意义。临床上常用高温、紫外线、酒精等物理或化学方法使细菌或病毒的蛋白质变性而失去致病及繁殖能力。在实践中，也有许多为提高某些生物制品的活性，要防止蛋白质的变性，如制取抗血清、疫苗等。,蛋白质的凝固作用(proteincoagulation),蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（4）蛋白质的胶体性质,蛋白质分子的颗粒直径已达1100nm，处于胶体颗粒的范围。布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。,透析,由于蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而小分子物质能透过半透膜,这样可把蛋白质分子与小分子物质分开,这个过程叫透析.,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（5）蛋白质的沉淀反应,1.中性盐沉淀反应：加盐使蛋白质沉淀析出-盐析稀盐可使蛋白质表面同性电荷增加，增加蛋白质分子间的排斥,同时与水分子间的作用增强,而增加溶解性盐溶作用；高盐破坏水膜、中和电荷,蛋白质聚集沉淀盐析,不同蛋白质盐析的盐浓度不同,故用不同盐浓度分级沉淀蛋白质,分离的蛋白质不变性。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。,方法,2.有机溶剂沉淀反应,用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取水膜,等电点时加入更易沉淀,不同蛋白质所需溶剂浓度不同-分级沉淀,但易引起变性，与有机溶剂浓度、作用时间和沉淀温度有关条件：低温（04。C），PH=PI,3.重金属盐沉淀反应,蛋白质在pHpI时为负离子,可与Cu2+/Hg2+/Ag+/Pb2+等结合为不溶性蛋白盐而沉淀,4.加某些酸类的沉淀反应,蛋白质在pHpI时带正电荷,可与苦味酸、磷钨酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等结合沉淀苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸、单宁酸、能沉淀生物碱，称生物碱试剂。,可逆沉淀(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2)在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。不可逆沉淀(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸、碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,（6）蛋白质的颜色反应,OH,N,（7）蛋白质的含量测定,1)考马斯亮蓝G-250法2）紫外吸收法3）凯氏定氮法4)其它方法,蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,2.6.2蛋白质的分离和分析技术,（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离a盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。b使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,（2）根据蛋白质分子大小进行分离,1）透析及超滤法透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,超滤,透析,2)层析法凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。,（3）根据蛋白质带电性质进行分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,（4）根据配体特异性进行分离,亲和层析法亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。,2.6.3蛋白质分子中氨基酸序列的测定,测定蛋白质分子中氨基酸序列的测定要求：a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上；b、知道蛋白质的分子质量，其误差允许在10%左右；基本原理：(1)测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的；(2)拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链。(3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成(4)鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基(5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段；(6)分离并测定各肽段的氨基酸序列；(7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；(8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。,具体方法,（1）多肽链的分离如果蛋白质含有一条以上的肽链，须分离纯化各肽链。试剂：8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度盐（2）拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键,方法如下:,过甲酸氧化法,用过甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成2个半胱氨磺酸。,还原法,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇（或二硫苏糖醇）处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化,Cleland试剂的还原作用,Clelands指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。Cleland试剂首先与蛋白质-S-S-形成中间物，反应终了，还原剂被氧化形成一个稳定的六环化合物，蛋白质则被还原。,(3)分析每一条多肽链的氨基酸组成,经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目常用6mol/LHCl水解蛋白质,(4)鉴定多肽链N末端残基,N末端分析方法:Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（异硫氰酸苯脂反应）氨肽酶法,DNFB法(Sanger法),黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定,丹磺酰氯法(DNS法),氨肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向内水解。NH2-aa-aa-aa-aa.根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,（5）C末端分析方法,肼解法羧肽酶法LiBH4还原法,肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。（注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必须烷基化后再肼解）,羧肽酶的方法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它专一地从肽链的C端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨基酸。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-