第四章-细菌的遗传分析.ppt

第四章细菌的遗传分析,第一节细菌的细胞和染色体第二节大肠杆菌的突变型及筛选第三节细菌的杂交和性别第四节中断杂交与重组作图第五节F因子和性导第六节转化与转导作图,第一节细菌的细胞和染色体,一、细菌的细胞：真核生物（eukaryotes)细胞有细胞核，进行减数分裂和有丝分裂；细菌是原核生物（prokaryotes)，没有细胞核，不进行减数分裂和有丝分裂。而是简单地复制和一分为二。,细菌染色体的着膜复制,二、细菌的染色体：细菌为单倍体，其染色体为环形双链DNA分子，不形成核小体结构。（P146图）三、细菌是遗传学研究的好材料：1.结构简单；2.世代时间短；3.后代个体多；4.各种突变类型多。,第二节大肠杆菌的突变型及筛选,一、大肠杆菌的突变类型:合成代谢功能突变型（anabolicfunctionalmutant):基本培养基完全培养基营养缺陷型（auxotroph)野生型（wildtype)缺陷型（deficient)原养型（prototroph)Met-甲硫氨酸突变型Met+Thi-硫胺突变型Thi+Pur-嘌呤突变型Pur+,2.分解代谢功能突变型（catabolicfunctionalmutant):lac-乳糖突变型，野生型为lac+3.抗性突变型（resistancemutant):Strr（Str-）抗链霉素突变型,Strs（Str+）链霉素敏感型Penr（Pen-）抗青霉素突变型,Pens（Pen+）青霉素敏感型T1r抗T1噬菌体，T1s对T1噬菌体敏感,二、突变型筛选：,1.根据菌落特点筛选：如Lac-突变菌株在伊红-美蓝培养基（EMB）上形成白色或粉红色菌落，而lac+菌落为有金属光泽的紫色菌落。2.抗性突变型的筛选：将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上，能形成菌落的就是抗性突变菌株。3.营养缺陷型的筛选：用印迹法(replica-platedmethod)把在完全培养基上生长的菌落影印到基本培养基上，鉴别出不能生长的克隆。再把它们转移到含有单一营养物质的培养基上，判定该突变型需要哪一种营养物质。,第三节细菌的杂交和性别（大肠杆菌的性别）,一、细菌的杂交二、F因子和高频重组三、细菌重组的特点,一、细菌的杂交（3个经典实验）,1.菌株A:met-bio-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸和生物素）菌株B:met+bio+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,出现若干原养型菌落，频率为10-7,）,2.U形管实验,3.菌株A:met-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸）菌株B:met+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,说明菌株A和B在杂交中的作用不同，A为遗传物质的供体(donor)，相当于雄性；而B为受体(recipient)，相当于雌性。,含有链霉素的基本培养基,二、F因子与高频重组,1.F因子（F-factor)：又称性因子或致育因子。它是能独立增殖的环状DNA分子。供体细菌：细胞质中具有F因子（F+，)。F+细菌表面有性伞毛(sexpili)，即F纤毛。受体细菌：不含F因子(F-，)。,F因子的结构,F因子由3个区域组成：原点(origin)：转移的起点；配对区域(pairingregion)：与整合有关；致育基因(fertilitygene)：使细菌具有感染力，其中有编码性纤毛的基因。,2.低频重组和高频重组:(1)F因子的转移低频重组,a.F+细胞与F-细胞接触并结合，形成细胞质桥(cytoplasmbridge)，即结合管(conjugationtube)。b.F因子进行滚环复制，通过结合管转移到F-细胞。c.F-细菌转变成F+细菌。,低频重组(lowfrequencyrecombination，Lfr)：F+与F-之间的杂交只有F因子的转移，因此尽管F因子的转移频率很高，但是供受体细菌染色体的重组频率却很低，约为10-6，因此F+品系称低频重组品系(菌株)。(P149图A)F+F-F+（2）细菌基因的转移高频重组(P149图B)高频重组(Highfrequencyrecombination，Hfr)：如果F因子整合到细菌染色体上，这种染色体上带有一个整合的F因子的品系，与F-细胞结合后可将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同的遗传标记时，可以观察到它们之间发生重组，重组频率可达到10-2以上，称为高频重组品系（菌株）。HfrF-F-（重组型）,F因子特点,F细菌可以把F因子传给后代；F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现；F可以和F杂交，给其复制后的F因子，使F变为F；F因子还可以改变细胞表面的构造，以防止F细菌间的接合；Hfr和F杂交时，F-受体很少得到完整的F因子，因此大多数重组子仍为F-。,三、细菌重组的特点,真核生物：完全合子原核生物：部分二倍体（部分合子），含有一个亲本的全部基因组和另一亲本的部分基因组。外基因子：供体Hfr提供的部分基因组；内基因子：受体F-提供的完整基因组。原核生物的遗传重组实质上是指受体中插入来自供体的遗传性不同的DNA片段，并把这种DNA片段或它的复本整合为受体基因组的一部分。,1.只有偶数次交换才能保证细菌染色体的完整性，产生平衡的有活性的重组子；2.重组子只有一种类型，相反的重组子(reciprocalrecombinant)不会出现。,第四节中断杂交与重组作图,一、中断杂交实验作连锁图：HfrF-Hfr:thr+leu+azistonslac+gal+strsF-:thr-leu-azirtonrlac-gal-strr混合培养,细菌开始杂交每隔一定时间取样，用搅拌器搅拌打断结合管，使配对的细菌分开，中断杂交，稀释菌液。,链霉素抗性半乳糖能否利用乳糖能否利用Tl噬菌体抗性叠氮化钠抗性亮氨酸合成能力苏氨酸合成能力,Hfr:thr+leu+azistonslac+gal+strsF-:thr-leu-azirtonrlac-gal-strr,混合完全培养基中断杂交一定时间含str的选择性培养基（基本培养基+str）选择到的重组子：thr+leu+strr（选择标记）,时间（分钟）转移的基因9-9azir11azirtonr18azirtonrlac+24azirtonrlac+gal+T=0：杂交开始；T=8分钟内，无重组菌落出现；T=9分钟，出现少量叠氮化钠抗性菌落，但对T1噬菌体还是敏感的。说明azir基因已经进入F-细菌，而tonr基因尚未进入。T=11分钟时，开始出现对T1噬菌体有抗性的菌落（tonr）；T=18分钟时，出现能利用乳糖的菌落(lac+)；T=25分钟时，出现能利用半乳糖的菌落(gal+)。,1.中断杂交实验结果,088.59111825,thrleuAzT1lacgal,2.中断杂交技术作图,根据供体基因进入受体细胞的时间顺序可以绘制连锁图，这就是中断杂交技术（interruptedmatingtechnique)。根据中断杂交绘制的基因连锁图，基因距离的单位是分钟而不是厘摩。,二、重组作图,当基因距离较近时，转移时间的间隔在两分钟之内，用中断杂交作图就不可靠，而必须用传统的重组作图(recombinationmapping)与中断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道lac比ade先进入受体，距离约为1分钟，则可进行以下杂交：,1.重组子的产生,2.重组频率的计算,用重组频率（RF）所测得的基因距离与用中断杂交技术以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cM,第五节F因子和性导,一、F因子Hfr准确切割F因子Hfr不准确切割FF因子(F-primerfactor)：是一种新的F因子，是带有插入细菌基因的环状F因子，即带有部分供体的F因子。F因子的产生缘于一种错误的切割。由于各自携带的基因不同，从而可以形成不同的F因子。,二、性导,利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程，叫做性导(sex-ductionorF-duction)。F因子转移细菌基因不同于Hfr菌株：1.Hfr:thr+leu+strsF-:thr-leu-strr重组子：F-(thr+leu+strr)，不能将thr+leu+再转入其它F-2.F:thr+leu+strsF-:thr-thr-strr重组子：F(thr+leu+strr)，能与其它F-杂交，并将thr+leu+转入其他F-，同时使其也具有F因子，成为F+。,三、三种致育因子的相互关系,三种致育因子F、F、Hfr的关系是：1.有F因子的细菌为F+，没有F因子的为F-，具有致育因子（F,F或Hfr）的菌株就是雄性菌株(malestrains)。2.F因子可以整合到细菌染色体上，形成Hfr染色体。不同的Hfr菌株是因为F因子的整合位点或方向不同。3.F因子又可以从Hfr染色体上剪切下来，产生F因子。如果剪切不准确而带有一段细菌染色体，则称为F因子。4.F因子很容易转移到F-细胞中，F+F-F+，但是供体染色体的转移频率则很低，重组频率很低。5.Hfr能以高频率把细菌染色体基因转移到F-细菌中，却极少使F-变为F+（因为F因子位于Hfr染色体的最末端）；6.F因子的性质介于F+和Hfr之间，即可转移自身，又可以转移细菌基因，但频率较低。,第六节转化与转导作图,细菌的遗传重组：实质上指受体中插入来自供体的遗传性不同的DNA片断，并使其整合为受体基因组的一部分。三种途径：接合：指通过供体与受体细胞之间的接触而传递DNA；转化：指游离的细菌DNA片段被吸收到不同的细菌细胞（受体）内，并整合到受体的基因组中；转导：指一种细菌的DNA片段经过温和的或有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。,1944年，Avery证实了这种转化因子就是DNA。,1928年Griffith发现肺炎双球菌的转化现象。,一、细菌的转化与作图,转化过程：,(1).双链DNA分子和细胞表面受体部位可逆性的结合；(2).供体DNA片段被吸收入受体细胞；(3).侵入受体细胞的供体双链DNA转变为单链形式，其中一条链被降解；(4).未被降解的一条单链DNA部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，与同源区段形成杂合的DNA分子；(5).杂合的DNA复制以后，形成一个亲代类型（受体）的DNA和一个供体与受体（重组类型）DNA结合的杂种双链DNA，从而导致基因重组形成各种类型的转化子。,3.确定连锁关系：,通过转化时DNA浓度降低时的转化频率的改变，判断基因之间的关系：A与B连锁（位于同一DNA片段）：则DNA浓度降低时，A、B同时转化频率的下降程度与A或B各自转化频率下降程度相等；A与B不连锁（位于不同DNA片段）：则DNA浓度降低时，A、B同时转化频率的下降程度远超过A或B各自转化频率的下降程度。,4.转化作图：,对于细菌的转化，其基因重组仍发生在供体与受体同源区域之间，只有偶数交换才能形成重组子，相反的重组子不出现。,3个基因的连锁图如下：,二、转导与作图,（一）转导现象的发现实验1：沙门氏菌LT22phe-trp-tyr-his+LT2phe+trp+tyr+his-基本培养基无菌落有菌落生成无菌落结果：与E.Coli的接合实验吻合。,实验2：U型管实验A:Phe-trp-tyr-his与B:Phetrptyrhis-,结果：不同于E.Coli的接合重组，不是通过细胞结合，而是通过一种可滤性因子(FA)实现的。,可滤性因子(FA)的特性,FA与沙门氏菌的温和噬菌体P22在生物学特性上的一致性：(1)P22的侵染力与FA的遗传力均可被脱氧核糖核酸酶和胰蛋白酶破坏；(2)用抗P22或用加热处理均可使P22的侵染力和FA的遗传能力失活，并且失活速率相同；(3)用抗P22的菌株作亲本进行上述混合培养，FA丧失侵染能力，不能出现重组体；(4)P22和FA在大小和质量上相同。证明了FA即为P22。,（二）转导转导(transduction):以病毒（噬菌体）作为载体将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌。供体A受体B1.普遍性转导(generalizedtransduction)：供体（细菌）染色体中所有基因具有同等机会被转导噬菌体导入受体细菌中，即噬菌体携带供体染色体片段是完全随机的。,噬菌体,（1）机制：,(2)共转导：,共转导(cotransduction)：两个基因同时被转导的现象称共转导，或并发转导。如果两个基因共转导的频率越高，则基因连锁越紧密；反之，共转导频率越低，则基因距离越远。据此可用于细菌染色体的基因作图。普遍性转导的频率较低，约为10-5，两个基因同时转导的频率则更低，仅有10-510-5=10-10。,利用并发转导频率判断基因之间的顺序：,3次双因子转导，结果如下：a、b共转导频率高a、c共转导频率高bacb、c共转导频率低,例1：三因子转导供体thr+leu+azs受体thr-leu-azr,选择性标记基因非选择性基因leu+50%azs2%thr+thr+3%leu+0%azsthrazleuthrleuazthrleuaz,例2：P1噬菌体供体C+A+F+受体C-A-F-得到转导子类型如下（C+为选择标记性基因）：(P161),C+A+F+36C+A+F-114C+A-F+0C+A-F-453603共转导频率(C-A)=(36+114)/603=0.25共转导频率(C-F)=(36+0)/603=0.06CAF注意：若两基因紧密连锁，很可能一起被转导，共转导频率接近1；若两基因距离远，则很难同时包含在同一转导的DNA片段中，共转导频率接近0。,附：两基因的物理图距d=L(1-3x)或x=(1-d/L)3d：同一染色体上两基因间图距；L：转导DNA的平均长度（约一个噬菌体基因组大小）；x：两基因共转导频率（3）流产转导：转导噬菌体虽将供体基因导入受体，但导入的野生型基因约有90%并未重组到受体染色体中，因此也不能复制。这种现象称为流产转导。（P162图）,练习：用P1进行普遍性转导，供体菌pur+nad+pdx-，受体菌pur-nad-pdx+。转导后选择到具有pur+的转导子，然后在100个pur+转导子中鉴定其它供体菌基因型，结果如下：,基因型菌落数nad+pdx+1nad+pdx-24nad-pdx+50nad-pdx-25100问：pur和nad的共转导频率；pur和pdx的共转导频率；哪个非选择性座位最靠近pur？nad和pdx在pur的同侧，还是两侧？,2.局限性转导(restrictedtransduction)：指噬菌体只能转导供体细菌染色体中的特定基因，又称特异性转导(specializedtransduction)。例如噬菌体专门转导E.Coli的gal或bio基因。噬菌体：1）是一种附加体(episome)，其有特定的附着位点attP(宿主的整合位点attB)；2）整合后使细菌成为溶源性细菌，噬菌体成为原噬菌体；3