09.07.30高三生物《血红蛋白的提取与分离2》(课件)

用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,二,实验操作,用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,二,实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,二,实验操作,血液有哪些成分？,血液,血浆,水分,其他物质,血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞(最多),血红蛋白(90),两个肽链,两个一肽链,四个亚铁血红素基团,血液有哪些成分？,血红蛋白,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,五倍体积,目的：去除()方法：()离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果)，然后用胶头吸管吸出上层透明的()，将下层()的红细胞液体倒入烧杯，再加入用()的()洗涤。,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,五倍体积,生理盐水,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,加()到()体积，再加40体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。,(2)血红蛋白的释放,加()到()体积，再加40体积的()(溶解细胞膜)，置于()上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放出血红蛋白。,(2)血红蛋白的释放,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏水,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:,(3)分离血红蛋白溶液,有机溶剂无色透明的甲苯层,脂类物质白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液红色透明液体,红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物,分离血红蛋白溶液,(4)透析,取()ml的血红蛋白溶液装入()中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的()中，pH为()，透析12小时，目的是()或用于更换样品中的()。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。,除去样品中分子量较小的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,(4)透析,1,利用透析袋透析,2.凝胶色谱制作,1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。,顶塞的制作：,组装：,安装其他附属结构。,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,注意,2）凝胶色谱柱填料的处理,2）凝胶色谱柱填料的处理,计算凝胶量,配置凝胶悬浮液,装填,洗涤平衡,凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,注意,缓冲液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,注意,装配好的凝胶柱,在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,思考,在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。,思考,你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？,思考,如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？,思考,3）样品加入与洗脱,50cm高,3）样品加入与洗脱,缓冲液缓慢下降,50cm高,加透析样品,注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动,注意,3）样品加入与洗脱,缓冲液缓慢下降,50cm高,样品渗入凝胶床：洗脱：收集：,加透析样品,收集得到的纯化后的蛋白,AVSEQ08.DAT,1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,三,实验结果分析与评价,观察你处理的血液样品离心后是否分层？如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,1.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,三,实验结果分析与评价,2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,1.在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,思考,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,1.在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,思考,2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,思考,2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,3.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,3.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,1.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D.二者根本无法比较,1.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D.二者根本无法比较,2.使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A.电荷的多少B.分子的大小C.肽链的多少D.分子形状的差异,2.使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A.电荷的多少B.分子的大小C.肽链的多少D.分子形状的差异,3.在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A.调节pHB.维持红细胞的能量供应C.防止微生物生长D.防止血液凝固,3.在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A.调节pHB.维持红细胞