1第七章 细菌和噬菌体的遗传分析

第七章细菌和噬菌体的遗传分析,第一节细菌和病毒在遗传学研究中的地位,1.细菌概述,(1).细菌的细胞：真核生物（eukaryotes)细胞有细胞核，进行减数分裂和有丝分裂，细菌是原核生物（prokaryotes)，没有细胞核，不进行减数分裂和有丝分裂。而是简单地复制和一分为二。(2).细菌的染色体：细菌为单倍体，其染色体为环形双链DNA分子，不形成核小体结构。,2.病毒概述,病毒无细胞结构，仅由蛋白质和核酸构成,可以分为:(1).动物病毒(2).植物病毒(3).细菌病毒（噬菌体,bacteriophage,phage）,3.细菌和病毒在遗传研究中的优越性（1）世代周期短，繁殖系数高（2）易于管理和进行生物化学分析，便于研究基因的作用（3）遗传物质比较简单，适宜用于研究基因的结构、功能及表达调控机制（4）便于研究基因的突变（5）可作为研究高等生物遗传表达调控的简单模型,第二节细菌和病毒的突变型及其筛选,一个正常的野生型（wildtype）基因突变为一个新的等位基因，叫做基因突变（genemutation）。带有突变基因并在表现型上显示出相对差异的个体叫突变型(mutant)。野生型：能在基本培养基上生长的野生型菌株。营养缺陷型：因丧失合成某些生活必需物质的能力，不能在基本培养基上生长的，突变型菌株。,形态突变：主要指菌落形态的突变，包括菌落大小、形状和颜色等可观察到的形态性状。,生理突变：(1).合成代谢功能突变型（anabolicfunctionalmutant):营养缺陷型（auxotroph)野生型（wildtype)缺陷型（deficient)原养型（prototroph)Met-甲硫氨基酸突变型Met+Thi-硫胺突变型Thi+Pur-嘌呤突变型Pur+(2).分解代谢功能突变型（catabolicfunctionalmutant)lac-乳糖突变型，野生型为lac+抗性突变型（resistancemutant)：Strr,Strs分别表示对链霉素有抗性和敏感T1r,T1s分别表示对T1噬菌体有抗性和敏感,一、细菌突变体的类型：,二、突变型的筛选,(1).根据菌落特点筛选：如Lac-突变菌株在伊红-美蓝培养基（EMB）上形成白色或粉红色菌落，而lac+菌落为有金属光泽的紫色菌落。(2).抗性突变型的筛选：将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上，能形成菌落的就是抗性突变菌株。(3).营养缺陷型的筛选：用印迹法(replica-platedmethod)把在完全培养基上生长的菌落影印到基本培养基上，鉴别出不能生长的克隆。再把它们转移到含有单一营养物质的培养基上，判定该突变型需要哪一种营养物质。,三、噬菌体的分类,烈性噬菌体：指侵入细菌细胞后，能立即破坏宿主细胞的遗传物质，导致宿主裂解的噬菌体。温和噬菌体：指侵入细菌以后，噬菌体的DNA或者独立存在于寄主细胞内，复制但不裂解宿主细胞，也不影响宿主细胞的正常代谢，如P1噬菌体。或者通过交换而整合到细菌的染色体上，进入溶原性（lisogeny）生活周期。整合在宿主染色体中的噬菌体称为原噬菌体（prophage），被溶原性噬菌体感染了的细菌称为溶原性细菌（lysogenicbacterium）。,四、噬菌体的突变型,（1）快速溶菌突变型：由于噬菌体的侵染，致使细菌细胞裂解的过程叫溶菌（bacteriolysis），致使菌落上出现一些圆形而清亮的小洞，称为噬菌斑（plaque）。野生型T2噬菌体裂解速度较慢，产生的噬菌斑小而边缘模糊，记为r+。突变型T2噬菌体裂解速度较快，产生的噬菌斑大而边缘清晰，记为r。因此可根据噬菌斑的大小来鉴别突变体。（2）寄主范围突变型：野生型T2只能浸染B菌株，不能感染B2菌株，记为h。野生型T2产生抗性突变，既能浸染B菌株，也能浸染B2菌株，记为h。当在含有B菌株和B2菌株的固体培养基上接种h后，出现半透明的噬菌斑，而接种h后，则出现透明的噬菌斑。,第三节.细菌的遗传分析,拟有性过程指的是细菌或病毒获取外源遗传物质，并发生遗传重组的现象或过程。因为细菌和病毒的遗传重组不同于真核生物，其遗传物质的传递是单向的，只有一种类型的重组型配子，相反的重组子因遗传物质不完整而不能成活。其实质是受体细胞通过双交换或偶数次交换，将来自供体的遗传特性不同的DNA片段或它的拷贝整合为自身基因组的一部分，从而形成杂合性DNA分子的过程。,7.3.1转化细菌通过细胞膜摄取周围环境中DNA片段，并通过重组将其整合到自身染色体中的过程，称为转化。（1）外源双链DNA分子和处于感受态的细胞的表面感受位点发生可逆性结合。（2）稳定结合在感受位点上的供体DNA片段被不可逆的吸入受体细胞。（3）侵入受体细胞的外源双链DNA在核酸外切酶作用下降解其中的一条链，转变成单链形式，并利用降解过程中产生的能量，将未被降解的另一条单链拉进细胞中。（4）未被降解的一条链部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，发生交换重组，从而形成杂合的DNA分子。（5）这种杂合的DNA复制后，形成一个亲代类型（受体）的DNA和一个重组类型（供体和受体）的DNA，并导致转化细胞的形成与表达。供体的单链片段进入细胞后与相应的受体DNA片段的同源性越高，越容易形成杂合双链。根据出现的遗传性状的变异，便可得知转化的发生。,7.3.1.2转化与重组作图,连锁基因间的距离越近发生共转化的频率越高，因而还可以根据共转化频率的高低来确定连锁基因距离的相对远近。只有发生转化作用形成杂合DNA分子，在随后的繁殖中才能发生DNA的交换重组，出现不同基因型的转化个体，即转化子（transformant）。而细菌为环状染色体，转化形成的杂合DNA分子只有发生双交换才能产生稳定的转化子，因此，可根据转化子的类型判断两连锁基因之间是否发生交换。若连锁基因间发生交换，则产生单独转化性状的转化子；若两连锁基因间未发生交换，则产生两个转化性状的转化子。因此，可根据转化子中某一性状单独出现的频率作为两基因间的交换率或图距来进行基因定位，绘制连锁图。即转化作图重组率的计算公式为：,7.3.2接合,接合（conjugation）是指通过“雄性”供体细胞和“雌性”受体细胞之间的直接接触，使遗传物质从由供体传递到受体细胞，并发生遗传重组的现象和过程。,(1).细菌的杂交,菌株A:met-bio-thr+leu+thi（+需甲硫氨酸和生物素）菌株B:met+bio+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,AB,完全液体培养基基本固体培养基平皿,A,B,这种营养的互补，是一些物质从一个菌株的细胞中泄漏出来而为另一菌株的细胞所吸收呢？还是菌株A和菌株B发生杂交后，出现重组，产生野生型的菌株呢？见课本的U型管实验，菌株不能通过，而菌液和营养物质能够通过！发现没有出现野生型菌株，因此，野生型菌株的出现，菌株间的直接接触必不可少！,A,B,(2).细菌的性别,菌株A:met-thr+leu+thi（+需甲硫氨酸）菌株B:met+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,AStrsBStrr,出现原养型菌落,AStrrBStrs,不出现原养型菌落,说明菌株A和B在杂交中的作用不同，A为遗传物质的供体(donor)，相当于雄性；而B为受体(recipient)，相当于雌性。,3.F因子,后来发现，供体和受体的性别差异，是由F因子引起的：供体细菌细胞质中具有F因子（F+)，受体细菌则没有F因子(F-)。F+细菌表面有性伞毛(sexpili)，即F纤毛。,(3.1).F因子的结构,F因子（F-factor)是一种质粒，又叫致育因子(fertilityfactor)，它由4个区域组成：原点(origin)：转移的起点配对区域(pairingregion)：与整合有关致育基因(fertilitygene)：使细菌具有感染力，其中有编码性纤毛的基因。DNA复制酶基因：与F因子自身复制有关,(3.2).F-细菌与F+细菌的结合和基因转移,F+细胞与F-细胞接触并结合，形成细胞质桥(cytoplasmbridge)，即结合管(conjugationtube).F因子进行滚环复制，通过结合管转移到F-细胞。F-细菌转变成F+细菌。,(3.3).F因子的整合和环出,F因子和细菌染色体都是环形DNA分子，F因子的配对区域中有一些可以与细菌染色体的多处的核苷酸序列配对的序列，称为插入序列（insertionsequence,IS)，通过IS的配对和交换，F因子可以整合到细菌染色体上，成为细菌染色体的一部分。象F因子这样即可作为一个复制子独立存在，又可以整合到细菌染色体上，作为细菌复制子的一部分的质粒或遗传因子称为附加体(episome),4.低频重组与高频重组,低频重组(lowfrequencyrecombination，Lfr)：F+与F-之间的杂交只有F因子的转移，因此尽管F因子的转移频率很高，但是供受体细菌染色体的重组频率却很低，约为10-6，因此F+品系称为低频重组品系(菌株)。2.高频重组(Highfrequencyrecombination，Hfr)：如果F因子整合到细菌染色体上，这种染色体上带有一个整合的F因子的品系，与F-细胞结合后可将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同的遗传标记时，可以观察到它们之间发生重组，重组频率可达到10-2以上，称为高频重组品系（菌株）。但是却很少使F-细菌转变成F+细菌。这个问题一度使遗传学家迷惑不解。,Wollman和Jacob想知道细菌杂交时，F+如何把基因转移给F-细菌。于1954年进行了以下杂交实验：HfrF-Hfr:thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-:thr-leu-azistonslac-gal-strr混合培养,细菌开始杂交每隔一定时间取样，用搅拌器搅拌断开结合管，使配对的细菌分开，中断杂交，稀释菌液，并影印到各种选择性培养基（selectivemedia)上，测定何时出现重组子。,5.中断杂交技术与作图,链霉素抗性半乳糖能否利用乳糖能否利用Tl噬菌体抗性叠氮化钠抗性亮氨酸合成能力苏氨酸合成能力,时间（分钟）转移的基因9-9azir11azirtonr18azirtonrlac+24azirtonrlac+gal+T=0：杂交开始；T=8分钟内，无重组菌落出现；T=9分钟，出现少量叠氮化钠抗性菌落，但对T1噬菌体还是敏感的。说明azir基因已经进入F-细菌，而tonr基因尚未进入。T=11分钟时，开始出现对T1噬菌体有抗性的菌落（tonr）；T=18分钟时，出现能利用乳糖的菌落(lac+)；T=24分钟时，出现能利用半乳糖的菌落(gal+)。,(5.1).中断杂交实验结果,(5.2).中断杂交技术作图,他们发现不仅Hfr细菌的基因重组进入F-有一定的时间顺序，而且越早进入的基因，它所达到的频率也越高。他们认识到，根据供体基因进入受体细胞的时间顺序可以绘制连锁图，这就是中断杂交技术（interruptedmatingtechnique)。根据中断杂交绘制的基因连锁图，基因的距离的单位是分钟而不是厘摩。因为基因在染色体上呈直线排列，Hfr细菌的染色体从原点(Origin,O)开始，以线性方式进入F-细菌。基因离原点越近，进入F-越早，越远则越迟。而每一次较远基因的转移，都意味着较近基因也要一同转移，因此，越早进入的基因，离原点越近，所能达到的重组频率也越高；越晚进入的基因，离原点越远，所能达到的重组频率也越低。,(5.3).F因子最后转移,如果让HfrF-杂交一直进行到2小时再中断，就会发现某些F-受体转变为Hfr,也就是说F因子最后也转移到受体，并使它成为Hfr供体，但是频率很低，说明F因子离原点最远。,F因子的插入使F+细菌变成Hfr菌株，而Hfr菌株的染色体上的F因子的转移造成了高频重组。由于F因子离原点最远，转移频率很低，所以很少使F-变成Hfr或F+。,TrpmalGalxyltsxmetBlacthiazithr,(4).大肠杆菌染色体是环形的,用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验，分别作成连锁图，发现基因转移的顺序、起点和转移方向却各不相同。据此可以推断大肠杆菌的染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不同。,HfrHothrazilactsxgaltrpmalxylmetBthiFCotsxlacazithrthimetBxylmaltrpgalFJ4othimetBxylmaltrpgaltsxlacazithrFP72ometBthithrazilactsxgaltrpmalxylF,细菌的接合也称细菌的杂交，是指细菌细胞之间产生接合管，一方的DNA通过接合管向另一方转移。,6.细菌的交换和重组,细菌的交换与真核生物不同，不是在两套基因组之间进行，而是在一套完整的基因组（F-内基因子，endogenote)和一个不完整的基因组（供体外基因子，exogenote)之间进行的，这样的细胞称为部分二倍体(partialdiploid)或叫部分合子(merozygote)。这是因为细菌结合管常会自发断裂，结合的过程往往在染色体尚未完全转移时就已经终止，进入F-的Hfr染色体也随之断裂，一般很少有整条Hfr染色体转入F-细胞。,供体外基因子F-内基因子,细菌的交换和重组的特点,F-受体很少得到完整的F因子，因此大多数重组子仍为F-。只有整条Hfr染色体都转移时，F-才能得到完整的F因子,变成F+(Hfr)。只有偶数次交换才能保证细菌染色体的完整性，产生平衡的有活性的重组子；如果内外基因子之间发生单交换，则环状染色体被破坏，产生不平衡的部分二倍体线性染色体，不能复制，细胞不能繁殖；重组子只有一种类型，相反的重组子(reciprocalrecombinant)不会出现。所以细菌的交换不是一个交互过程，而是单向的。,7.重组作图,当基因距离较近时，转移时间间隔在两分钟之内，则用中断杂交作图就不可靠，而必须用传统的重组作图(recombinationmapping)与中断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，如果进行以下杂交：,(7.1).重组子的产生,(7.2).重组频率的计算,用重组频率（RF）所测得的基因距离与用中断杂交技术以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是1分钟相当于20%重组值，即