选123分解纤维素的微生物的分离

课题3分解纤维素的微生物的分离,专题2微生物的培养与应用,1、简述纤维素酶的组成及作用。说出刚果红染色法及其原理（重点）2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。（重、难点）,纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。农作物秸秆中富含大量的纤维素，但被人类利用的机会少、效率低。,课题背景,植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,对这些微生物的研究与应用，使人类能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,如何分离土壤中分解纤维素的微生物呢？,其消化道内，共生有分解纤维素的微生物，能产生纤维素酶而分解纤维素。人没有分解纤维素的能力,植食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,纤维素与纤维素酶,1.纤维素:,多糖(高分子化合物)基本单位:葡萄糖,一、基础知识,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，然后再利用。,许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羟甲基纤维素钠（CMC-Na）、不溶于水的微晶纤维素（Avicel）等。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,2.纤维素酶,（1)组成：,（2)作用：,一种复合酶：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,取二支20mL的试管。,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张1cm6cm的滤纸条。,各加入pH4.8，物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml。,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶。,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h。,结果：乙试管的滤纸条消失。,讨论：自变量？因变量？无关变量？乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,自变量：纤维素酶的有无自变量的控制：乙试管-1mL纤维素酶溶液甲试管-等量的缓冲液(不能加蒸馏水，会影响溶液的pH)。,刚果红染色法,（二）纤维素分解菌的筛选,2、原理：,1、方法：,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而与水解后的纤维二糖和葡萄糖不发生这种反应。,红色复合物,红色消失，出现透明圈,四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈,(选择培养基中通过颜色反应直接对微生物进行筛选),不同菌落的透明圈大小不同，可以说明微生物产生纤维素酶能力的大小。,不同菌落的透明圈大小不同可以说明什么问题？,（二）纤维素分解菌的筛选,四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈,透明圈的应用：,筛选具有某种特定功能（如分泌某种酶）的微生物（目的菌）.,在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/mL的刚果红（简称CR）溶液，1015min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将出现透明圈。,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。,方法1：,3、操作：,NaCl溶液作用：漂洗作用洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。,方法1：,3、操作：,在倒平板时就加入刚果红。,方法2：,配制质量浓度为10mg/mL的刚果红（CR）溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。,NaCl溶液作用：漂洗作用洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,在倒平板时就加入刚果红。,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。,方法1：,方法2：,3、操作：,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐。刚果红会使菌落之间发生混杂。,操作简便，不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈。2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,这两种方法各有哪些优点与不足？,NaCl溶液作用：漂洗作用洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。,二、实验设计,(1)分布环境:,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,(2)原因:,二、实验设计,取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？,纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。因此，选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。,如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中，能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,1、土壤取样：,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,(1)目的：,思考：用什么方法选择？,纤维素分解菌的选择培养基,碳源、能源,无机盐,生长因子、碳源、氮源,氮源、生长因子,A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，以纤维素粉作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。,C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。,自变量为培养基的种类（即普通培养基和选择培养基）。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照；或者将纤维素粉改为葡萄糖。,(2)制备选择培养基：,酵母膏，是以新鲜酵母乳液经酶解、分离、浓缩得到的一种棕黄色可溶性膏状（酵母浸膏）或浅黄色粉状（酵母浸粉）纯天然制品,富含蛋白质、必需氨基酸及B族维生素、核甘酸、微量元素等。主要作用是补充氮源和提供生长因子。,水解酪素，即水解酪蛋白，酪蛋白水解后得到的白色或浅黄粉末、易溶于水、极易潮解、具有酱香味。氨基酸种类齐全。因此常用于制备培养基。主要作用是提供氮源和生长因子。,纤维素粉主要碳源。,液体培养基,选择培养基,对照实验,牛肉膏蛋白胨培养基,碳源：纤维素粉葡萄糖,(3)操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,(2)制备选择培养基：,(能分解纤维素的微生物可以大量繁殖),为什么？,微生物大量繁殖,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,3.梯度稀释,此培养基为固体培养基在其中加入刚果红可形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，据此可筛选到纤维素分解菌。,(水溶性羧甲基纤维素钠),4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,(1)制备鉴别培养基:,碳源,碳源、氮源、生长因子,无机盐,凝固剂,碳源、生长因子,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,CMCNa（纤维素钠)主要碳源。,固体培养基,鉴别培养基,加入刚果红（前置染色法/后置染色法）,出现透明圈,鉴别与筛选纤维素分解菌,将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,(2)涂布平板：,(1)制备鉴别培养基:,5.挑取产生明显的透明圈的菌落（即为分解纤维素的菌落）纯化培养。,纤维素分解菌,液体培养基,固体培养基,纤维素,CMC-Na,使纤维素分解菌迅速增殖,鉴别与筛选纤维素分解菌,选择培养基与鉴别培养基比较,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落（产生明显的透明圈）,什么样的环境取样?,培养的目的?选择培养基的特点?,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,原因：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找。,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,刚果红染色法,二、实验设计,小结：,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,不同：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液稀释涂布在鉴别（选择）培养基上进行分离和纯化。相同：其他步骤基本一致。,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,课题2:,土壤取样,选择培养基,直接分离,菌落(分解尿素的细菌),（尿素为唯一氮源）,选择培养,稀释涂布平板法,课题3:,土壤取样,选择培养基,(纤维素分解菌),（纤维素为主要碳源）,稀释涂布平板法,鉴别培养基,透明圈,挑选菌落,（刚果红染色法）,课题3分解纤维素的微生物的分离,三、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,2.分离的结果是否一致,由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,四、课题延伸,2、纤维素酶的测定方法:,对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量进行定量测定。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。,1、纤维素分解菌的鉴定：,发酵产纤维素酶实验,液体发酵,固体发酵,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在主要以纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,课题2与课题3相关比较,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,1.【生物选修1：生物技术实践（15分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即和。,石油,选择,平板划线法,稀释涂布平板法,当堂训练,为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力。通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有、和。无菌技术要求试验操作应在酒精灯附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。,强,灼烧灭菌,干热灭菌法,高压蒸汽灭菌法,火焰,2如图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题：,（1）要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明。（2）接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用法，原因是。（3）用稀释涂布平板法统计菌落数目时，最好选择菌落数在间的平板进行计数。若统计出在一稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为30个，所用稀释液的体积为0.2mL，则每克样品中的菌落数为。,寻找目的菌，根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找,释稀涂布平板,平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数,30300,1.5107个,3从自然菌样筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样富集培养纯种分离性能测定。（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从环境采集。（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择的培养基，并在条件下培养。（3）下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。,获得图A效果的接种方法是，获得图B效果的接种方法是。（4）配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行，培养基接种前要进行，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在条件下进行。,海滩等高盐,以淀粉为唯一碳源,高温,稀释涂布平板法,平板划线法,调节pH,高压蒸汽灭菌,无菌,4有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。纤维素酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产量，请你设计一个实验，利用诱变育种的方法，获得产生纤维素酶较多的菌株。（1）写出实验步骤：将培养好的生产菌株分成两组，。制