诱变育种加上lys育种实例VIP

第二部分工业微生物诱变育种,第一节诱变剂,第二节、诱变育种步骤与方法,诱变,第一节诱变剂,一、诱变剂和诱变处理,诱变剂（mutagen）：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变频率的物理因子或化学物质。,物理诱变剂：紫外线、X射线、射线，快中子；化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。,诱变剂,物理诱变剂,化学诱变剂,非电离辐射,碱基类似物5-BU，5FU，2-AP，2MP,电离辐射,紫外线,机制,快中子X射线r射线,烷化剂,单功能,多功能,亚硝基胍NTG,机制,甲基磺酸乙酯EMS,硫酸二乙酯DES,移码突变剂吖啶类，ICR,机制,两个碱基间插入吖啶类分子,常用诱变剂的诱变机理,使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,第二节、诱变育种步骤与方法,出发菌株的选择,处理菌悬液的制备,诱变处理,中间培养,分离和筛选,诱变育种前的准备工作,诱变前对出发菌株的了解,了解菌种特性与生产性能的关系,了解影响菌种生长发育的主要因素,了解菌种有效成分中各组分在代谢合成过程中与培养条件的关系,建立一个准确、简便、快速检测产物的方法,研究最佳的菌种保藏培养基和条件,区分不同菌落类型出现不同菌落类型的原因,培养基斜面制备技术移种密度温度药品和原材料,一出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3采用有利性状的菌株，如生长速度快，产孢子早而多。4某次诱变后对其他诱变剂敏感的菌株。5采用“增变菌株”。6在选择氨基酸或核苷酸的出发菌株时，应考虑能少量积累所需产物或其前体的菌株，选择抗生素的出发菌株时，选择每次诱变效价都有一定提高的菌株。,（一）一般出发菌株的要求,（二）选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株（三）选择纯种作出发菌株。（四）选择出发菌株应考虑其稳定性。（五）连续诱变育种过程中如何选择出发菌株（六）选择出发菌株的其他因素（七）采用多出发菌株（八）菌种的代谢特点,二单孢子悬液的制备,（一）菌悬液制备的要求如下：1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。（同步、旺盛、单细胞或单核孢子）2、细菌选择对数期，孢子刚刚成熟的新鲜孢子。（霉菌孢子浓度106ml放线菌孢子浓度106-107ml）3、对不产孢子的真菌4、制备原生质体为诱变材料,菌丝尖端法处理菌落周围的尖端菌丝混合培养法,原生质体是异质的不具有细胞壁不产孢子的菌株诱变时会有遗传分离或遗传不稳现象,（二）菌悬液制备的方法：,细菌经2024h培养的新鲜斜面,基本培养基培养至对数期,于6培养1h，使之同步,加入一定的嘧啶嘌呤或酵母膏培养2060min,离心用生理盐水或缓冲液制备菌悬液,用盛有玻璃珠的三角瓶中分散,无菌脱脂棉或滤纸过滤,菌体计数、调节浓度,三诱变处理,（一）诱变剂种类的选择1、根据各种诱变剂诱变机理和菌株的特性2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂3、参考出发菌株原有的诱变系谱来选择,对遗传稳定的菌株，采用从前没使用过、突变谱宽、诱变效果强的诱变剂对遗传不稳定的菌株，先自然分离，然后用温和的诱变剂或诱变史上有效的诱变剂。,40,突变频率,正突变,处理时间,负突变,亚热带链霉素的白霉素高产菌39#X射线辐射量与变异的关系,低产的B12产生菌乙烯亚胺处理时间与变异的关系,（二）最适诱变剂剂量的选择,（三）诱变剂的处理方式1、单因子处理2、复合因子处理：两个以上的因子同时处理不同诱变剂交替处理同一种诱变剂连续重复使用紫外线光复活交替处理,（四）诱变处理中影响突变率的因素1、菌种的遗传特性不同2、菌体的细胞壁结构不同3、环境条件的影响诱变前预培养和诱变后培养温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响平皿密度效应,四中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。表型延迟（phenotypelag）：指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型必须经过2代以上的遗传复制。,方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几