真菌感染实验诊断

第三章真菌感染实验诊断,第一节真菌的基本特性真菌是一大类具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。,一、真菌的形态特性,（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。（二）多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称丝状菌或霉菌。,菌丝和孢子的形态因菌而异，是鉴定真菌的重要依据。孢子又分为多种，如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。,二、真菌菌落特性,真菌培养要求不高，常用沙氏(Sabouraud)培养基(含1蛋白胨、4葡萄糖或麦芽糖、2琼脂)培养，适宜温度2228，但深部真菌为37。形成三种菌落，菌落形态是鉴别真菌的重要依据。,1酵母型菌落是单细胞真菌的菌落，形态与细菌菌落相似，较大，表面光滑湿润柔软、边缘整齐，如新生隐球菌。,2.类酵母型菌落如白假丝酵母菌，形成假菌丝，伸人培养基中。,3霉菌型菌落是多细胞真菌的菌落。菌落呈棉絮状、绒毛状，并产生不同的色素，如皮肤癣菌。,第二节标本采集及检验程序,一、临床标本的采集(一)临床标本类别1皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、皮屑等。,2各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。,3血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。4脓汁及渗出物。,(二)采集标本注意事项,1.采集的标本要适宜不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深部真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。,2在用药前采集标本一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。,3采集的标本量要足血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份(一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。,4严格无菌操作并进行消毒处理，尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。5采集标本立即送检深部真菌标本最长不得超过2h。,第三节真菌检验,一、标本直接检查(一)显微镜检查直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病标本多用KOH湿片检查法，即取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上，加1滴10-20KOH液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。,直接镜检的意义,直接镜检阳性表示：有诊断意义，如浅部真菌病等；看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种,如假丝酵母菌的厚膜孢子等；,判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。,直接镜检也有局限性：阴性结果不能排除真菌感染；有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。,(二)抗原检测,常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫法。均应设对照，防止发生假阳性和假阴性。,用胶乳凝集试验检测标本中的白假丝酵母菌甘露聚糖抗原。用胶乳凝集试验和ELISA检测血清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗原，在治疗前检测非常敏感特异。,用半定量放射免疫法检测血清、尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原，可快速诊断。,二、真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养真菌的温度为28，但深部真菌为37。菌落是鉴别真菌的方法。注意以下几点：,菌落性质：酵母菌还是霉菌；菌落大小，病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；,菌落颜色病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。,三、真菌的生化反应,用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。1.糖(醇)类发酵试验37孵育，观察糖发酵情况。,2.同化碳源试验含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45)混合，然后在培养基上分别加糖，置25孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化周围有生长圈，否则无生长。,3.同化氮源试验同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。,四、动物实验,实验的目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮质部位有白色脓疡。,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基G+Cmol分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR指纹、随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段测序等。,（一)G+Cmol分类鉴定法,常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中点值温度为热变性温度（Tm）。若真菌DNA中G+C碱基对含量多，Tm值就高。可直接反映G+C碱基对的绝对含量。计算公式为：G+Cmol=(Tm-53.9)2.44,(二)真菌核型的脉冲电泳分析,脉冲凝胶电泳技术(PFGE)解决了真菌大分子DNA的分离技术难题。,原理：PFGE有两个方向的电场在设定的脉冲时间里交替变换，使大分子DNA在移动中不断改变自己的形状及迁移方向，从而绕过细小的凝胶孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳动慢些，较小的快些，有许多因素影响电泳带型，分离真菌等大分子量的DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。,用PFGE分析真菌核型，可直接比较其遗传背景,从电泳核型差异中进行分类鉴定,又能取得基因结构的基本数据，构建出大尺度物理图谱。,(三)随机扩增多态性DNA(RAPD)分析,RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量的多态性，从而比较靶基因差异的一种技术。由于病原性真菌基因组庞大，RAPD分析适用于真菌的鉴定与分类。,六、真菌毒素的检测,真菌产生有毒的代谢产物，可引起急慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症状，而且可进入人体内引起病变，如引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素；引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄曲霉毒