环境工程微生物学-微生物污染及其检测技术

第8章微生物污染及其检测技术,微生物与环境污染,水体中的病原微生物,表10-1通过粪便进入水体的病原体,水体中的主要病原微生物类群,沙门氏菌属(Salmonella）志贺氏菌属(Shigella）霍乱弧菌(Vibriocholerae)肠道病毒属(Enterovirus)甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus）,Salmonellatyphimurium(red)invadingculturedhumancells,LT2A-SL1344genome,Shigellasonne的部分特性,Shigellatyphimurium,微生物代谢物与环境污染,氨硝酸与亚硝酸氮氧化物硫化氢酸性矿水甲基汞农药代谢的毒性产物细菌毒素肉毒毒素(botulin)葡萄球菌肠毒素放线菌毒素放线菌素链脲菌素洋橄榄霉素,真菌毒素以黄曲霉毒素为例剧毒,黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Asp.parasiticus)产生紫外线照射下可发出荧光B族和G族，蓝色荧光和绿色荧光已确定结构的黄曲霉毒素有17种，其中以黄曲霉毒素1毒性最大，致癌力最强。藻类毒素甲藻蓝细菌毒素:微囊藻快速致死因子(MicrocystisFDF),第一章环境监测中的微生物学方法,当环境受到污染后，环境的物理性质、化学性质和生物学特性发生变化,如：重金属离子、NO3-浓度增加；水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。,如何监测？,化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。,一、空气微生物来源空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。土壤中飞扬起来的灰尘；水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。,第一节空气的卫生学检验,微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成“气溶胶”，借风力传播。空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中。,InfectionTransfer-AirborneDropletNuclei,二、空气微生物的卫生标准目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内1m3空气中细菌总数为501,000个以上作为空气污染的指标。,病原菌在空气中易死亡，但结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。,表2-1不同场所上空微生物的数量（个/m3）,表2-2以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3）,三、空气的微生物监测,采用营养琼脂平板计数法。培养皿直径为d90mm和d100mm。评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。细菌指标：细菌总数和绿色链球菌必要时测定病原微生物。,(一)空气微生物测定,1固体法平皿落菌法(沉降平板法)、撞击法(缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器)过滤法。(1)平皿落菌法培养基融化倒入d90mm无菌平皿制成平板,置于待测点(通常5个)，打开皿盖暴露于空气510min，盖好皿盖，30培养48h；计菌落数。,通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。奥氏假设：5min内落在面积100mm2营养琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的细菌数相同。奥氏公式：式中：C空气细菌数；A捕集面积，cm2；t暴露时间，min；N菌落数，个。,简化后：奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密度和活动情况。,(2)撞击法：以缝隙采样器为例，用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有0.15mm、0.33mm和1mm三种)抽吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距2mm，平板转速:1r/min、5-60r/min、60r/min。,根据空气中微生物密度调节平板转动的速度含菌高，转动快；含菌低，转动慢。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。采样器的规格各国不一，操作有差异。,培养前,培养后,撞击法检测空气中微生物数量,2、液体法,测定空气中悬浮微生物，主要细菌将一定体积的含菌空气通入无菌蒸馏水，使微生物均匀分布在水中，取一定量菌液于无菌培养皿中，倒入15-18ml融化的培养基，混匀、冷凝成平板，37培养48h，计菌落数。以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空气中的细菌数量。,例如：10m3含菌空气通入100mL的无菌水，微生物全部截留在水中。取0.1mL菌液涂布于平板上，长出100个菌落，则10mL水中含菌10,000个，10m3空气含有10,000个。1m3空气含有1,000个。,(二)空气微生物的检测点数,空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以2030个测点数为宜，最少测点数为56，见表。,表1日本有关标准测点数的规定,摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998,表2按美国联邦标准209E方法计算的必要测点数,表3浮游菌最小采样量,表4落菌法测细菌所需要的最少培养皿数(沉降0.5h),第二节水质的细菌学检验,一、细菌总数将定量水样（原水样或稀释水样1mL）接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板37C培养24hr后观察结果，计菌落数，计算原水样每毫升的细菌总数。具有相对的卫生学意义：菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染的可能性亦大（为什么？）。,二、粪便污染指示菌,人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即粪便污染指示菌为代表。以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的指示。,健康成人粪便内的微生物数量,（一）指示菌的理想条件,大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；受粪便污染的水中易检测出，未受污染的水中无检测；在水体中不会自行繁殖；存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌；检出及鉴定方法比较简易迅速；适用于各种水体。,（二）适宜的指示菌,总大肠菌群，粪大肠菌群、大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）克雷伯氏菌属。,三、大肠杆菌,（一）特征大肠杆菌定义：一群需氧或兼性厌氧性的G-无芽孢杆菌，37C培养24hr，能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全部兼性需氧性G-杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。成人粪便排出菌数可达(5100)106cfu/d。,（二）大肠菌群的测定常用多管发酵法或滤膜法。发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法初发酵（推测试验）将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等糖类的培养液(3倍或1倍乳糖液),37C培养24hr，观察产酸产气情况，初步判断是否有大肠菌群存在。,2）平皿分离（证实试验）,水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，37C培养24hr，根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片，革兰氏染色证实是否为大肠菌群。,3）复发酵试验（完成试验）,将大肠菌群疑似菌落再次接入1倍乳糖液，37C培养24hr，产酸产气者即确证为大肠菌群。,结果计算产酸、产气记为阳性反应，不产酸、不产气记为阴性反应。根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。,2滤膜法,发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：1）水样过滤：选用微孔滤膜，灭菌后抽滤一定量的待测水样，将水中的细菌截留在无菌滤膜上；2）培养：将滤膜有菌面朝上贴于伊红美兰培养基或远藤氏培养基，经37C培养16hr18hr；,3）结果观察：培养16hr18hr后，挑选深红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。G-：接入乳糖培养液中，复发酵；G+：阴性结果。经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳糖蛋白胨半固体培养基中，37C培养68hr，