western blot技术

WesternBlot技术,姓名：=,印迹法,Southern印迹法Northern印迹法Western印迹法Eastern印迹法,印迹法（blotting）:将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,CompanyLogo,WesternBlot原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,CompanyLogo,WesternBlot原理,经电泳分离后的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,一.制备、处理蛋白样品通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白将待分离的蛋白样品与样品缓冲液按4:1比例混合(50100g蛋白),沸水煮沸10min,立即插入碎冰中备用。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,二.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳制备聚丙烯酰胺凝胶：将玻璃板洗净,水不挂壁为准,晾干,底边和两侧对齐,两侧夹紧,立于制胶架上。根据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶,沿玻璃板上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中,待分离胶聚合、凝固后,将积层胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即插入梳子。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,二.SDS聚丙烯酰胺凝胶上样：将制备好的凝胶(带着梳子)小心从制胶架上取下,放置于电泳槽槽中,将电泳缓冲液注入电泳槽中,缓慢拔出梳子，吸取处理好的蛋白样品2030LL点样。电泳：打开电源,选择稳压模式电泳(也可选择恒流电泳),80200V工作电压，积层胶用80-100V,分离胶用150-200V。待溴酚蓝到达分离胶底部时(约1h后)停止电泳。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,三.转膜取胶：电泳结束后用塑料板小心将胶从两块玻璃板之间剥离出来，用转移缓冲液洗净。制作转移三明治：打开转移盒，三明治顺序：正极面海绵垫3张Whatman滤纸PVDF膜凝胶3张Whatman滤纸海绵垫负极面。关上转移盒。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,三.转膜转移：将转移盒放入转移槽，正极面对红板，负极面对黑板，加满转移缓冲液，通电转移，将转移槽放入4冰箱内，200mA转移2h。洗膜：打开三明治，取膜。将膜浸泡于TBST中，置于摇床上洗膜10min.,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,四.封闭将转移膜取下，用PBS漂洗,放入小塑料袋中,加入适量新鲜封闭液,挤赶气泡,用电热封口机封口后室温下放在摇床上摇。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,五.免疫反应加一抗：将封闭过的膜取出,再放入一新塑料袋中,加入一抗液,挤赶气泡,封口。室温下在摇床上摇1h,或4冰箱放置过夜。洗膜：用TBST洗膜液洗去未结合靶蛋白的抗体。加二抗：将漂洗过的膜放入新塑料袋中,加入二抗液。室温下在水平摇床上摇2h。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,六.底物显色化学发光反应(ECL)检测放射自显影底物荧光ECF底物DAB呈色,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,六.底物显色化学发光反应(ECL)检测：取出洗过的滤膜,先在滤纸上沥干。将膜放入小暗盒中,加发光液于膜上,室温孵育3min,立即准备压片曝光。,CompanyLogo,WesternBlot操作步骤,六.底物显色曝光及冲洗X光胶片：在暗室中观察发光条带的强度,确定曝光时间。将X光胶片放在暗盒中的滤膜上,盖严,计时曝光,冲洗X光片。分析：用凝胶成像系统扫描图像，检测积分吸光度值,分析目标带的分子量和净光密度值。,CompanyLogo,WesternBlot所用仪器,CompanyLogo,WesternBlot常见问题分析,一.条带比正常的窄？出现“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲；样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度；胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适。,CompanyLogo,WesternBlot常见问题分析,二.凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min；电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸；确保膜和胶块之间没有气泡；缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温。,CompanyLogo,WesternBlot常见问题分析,三.背景太高？原因膜没有均匀浸湿；膜或者缓冲液污染；封闭不充分；抗体与封闭剂出现交叉反应；抗体浓度过高。,CompanyLogo,WesternBlot常见问题分析,三.背景太高？解决办法转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿；拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液；检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应；杂交前检测一抗、二抗的工作浓度。,CompanyLogo,WesternBlot技术,总结WesternBl