CE分离条件的优化方法

毛细管电泳分离条件选择策略,概述,毛细管电泳分离条件选择的内容很多，且与样品、分离模式、检测方式、进样方法乃至仪器系统结构等相关，但有许多共同之处，这里将对普遍性的问题进行考察，包括毛细管电泳模式选定、仪器操作条件确定、介质选择等。,毛细管电泳模式的选定,毛细管电泳有许多不同的模式，因而在分离样品前必需很好选择分离模式，以达到最佳的分离结果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普适性、选择性、样品特异性等。,毛细管电泳模式的选定,以简单性为原则时，所选分离模式的操作、条件优化、分离控制等必需是最简单和最容易的，而且富于后续变化。根据这一道理，首先应该考虑自由溶液分离模式，最后才考虑填充形式的分离模式。简单性原则是毛细管电泳模式选择的一般规则。,毛细管电泳模式的选定,在分离生物样品时，通常需要根据分离的目的来选择分离模式：欲测定样品的尺寸，就须选NGCE或CGE，偶可选用CZE或MEKC；要测定样品的等电点，则应选用CIEF；在进行亲和作用研究时，则应当首先选用ACE。,毛细管电泳模式的选定,我们的分析目的可能并不是单一的，这时的分离模式选择，就应该注意考虑其通用性。CZE、MEKC和CEC的通用性和可调节性都较大，但根据简单性原则，还以CZE或MEKC为优。注意，填充型毛细管电泳不适合于颗粒样品的分离，甚至也不适合于大分子分离。,毛细管电泳模式的选定,有时，我们会特别注重分离的选择性，即只希望把目标组分分离出来。此时应优先考虑选择性高的分离模式，如ACE等。如果已知样品的某些特性，也可以据此选择分离模式，比如在分离蛋白质和多肽等两性样品时，可以优先考虑CIEF；在分离中性分子时，优先考虑MEKC；在分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式等。,毛细管电泳模式的选定,实际样品五花八门，性质各异，分离模式的选择是可变的和灵活的。这种灵活性恰好与毛细管电泳模式间的易换性相吻合。,基本操作条件选择,这里所谓的操作条件包括：电泳电压、温度、毛细管尺寸、进样方法、检测条件等，下面分别讨论之。,电泳电压,理论和实验均表明，效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，则极大电压可能会超出仪器的控制范围，此时没有最佳电压，可选用仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压有可能很小，若此时的分离度很高，也可以选择大于极大值的电压进行分离。,电泳电压,极大电压可以利用理论计算或实验测定来获得。利用理论效率方程，通过求极值的方法可以确定极大电压。理论计算过程往往繁琐，而且也不很可靠，通过实验测定来确定工作电压其实非常简单。根据欧姆定律，电流和电压具有线性关系，如能测定电压与电流的关系曲线就不难确定工作电压。,电泳电压,方法如下：在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）；做电压电流曲线；取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。,电泳电压,除工作电压选择外，还应考虑电压施加方式的选择。理论上，毛细电泳可有恒流、恒压、恒功率、梯度升（降）压分离等不同的工作方式。目前，绝大多数分离采用瞬间升压的恒压工作方式。实际上，采用恒流工作方式有利于提高分离的重现性，在没有良好恒温控制的系统上进行电泳时，建议采用恒流或恒功率操作。经验表明，采用升压（升流）分离，可以有效提高分离度，有条件时，应当充分考虑线性升压的工作方式。在微量制备研究中，还需要考虑降压分离过程，以便于馏分的准确收集。,电泳温度,电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制旨在避免管内溶液因过热而出气泡或沸腾，显然温度越低越好；重现性控制意在避免温度波动；分离效率控制的目的在于提高分离度，依据样品性质的变化而高低不等，需由实验来测定。此外，某些介质对工作温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。,电泳温度,多数情况下，在2030之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。如若不然，便需调整或优化温度。优化多从室温开始，向上搜寻，若无结果，再向下搜寻。不少糖类样品需要高于室温的分离环境，有些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。,电泳温度,毛细管电泳温度的选择，目前还受到仪器条件的限制，大多数商品仪器只能在2050之间进行选择，而且不能实现温度梯度控制。此方面的研究还有待进一步展开。,电聚焦,当离子从高电场突然进入低电场时，会因减速而堆集在电场交界处，导致区带缩短、浓度提高，进而提高检测灵敏度和分离效率。电场聚焦进样需要至少一个台阶电场梯度。利用温度梯度、粘度变化（CGE）、电解质浓度梯度等方法都能构建出电场梯度，其中电解质浓度梯度法最简便实用，可分简单电聚焦、增强电聚焦和整管进样聚焦等方法。,简单电场聚焦,设样品中的电解质浓度比电泳缓冲液低得多，则在进行电动进样时，电场就会基本加在样品与管口之间，而很少加在毛细管中。如此，样品就会快速迁移到管口并突然减速堆积。仅需把样品配制在低浓度缓冲液或纯水中就能降低样品中的电解质浓度。此法可提高检测灵敏度210倍。用水配制样品，由压力进样，也可在电泳初期产生聚焦现象，但聚焦时间很短，检测灵敏度的提高有限（不大于2倍）。,增强电场聚焦,利用压力法先进一段水区带，然后用电迁移法正常进样，可以增强聚焦效果。纯水区带的电导趋于零，在电动进样期间将承受所有的电场，而管内其他部位电场趋于零。在此情形下，不产生电渗（不满足电渗产生的第一个条件），仅一种符号的离子（取决于电场方向）可迁入管中并迅速穿过水区带、浓集于它的前沿。如想同时分离异号离子，则需用正负电场顺序进样各一次。,增强电场聚焦,本进样法成功的关键在于水区带和样品区带长度比的控制，一般需通过实验来优化。研究表明，水区带最好不要长于2mm，电迁移进样时间应控制在1min以内。在优化条件下，本法可提高检测灵敏度102103倍而不损失分离效率。一种简化的方法是：用压力法顺序引入水、样品和电泳缓冲液区带，然后加电压分离。在分离初期，正负离子各自聚焦在水区带的前沿和后沿。本方法可提高检测灵敏度一倍以上。,整管进样,如果样品溶液过稀，则可将其灌满整根毛细管，并施加反向分离电压至电流上升到正常值的95%，然后改变电压方向进行正常电泳分离。其机制是：在反向电压下，电渗将电泳缓冲液从毛细管的（正常）出口泵入并引起此部位电场突降，这时，逆电渗而动的离子，在逾越突降面时就会减速、堆积，同时又被快速的电渗推回。这种过程连续不断地进行，直至缓冲液到达进口时才被强行停止。本聚焦方法具有方向性，如毛细管产生从正到负的电渗，只浓集负离子，若产生从负到正的电渗则浓集正离子。,pH聚焦,本法适用于弱解离样品，尤其适用于两性样品。这类样品在经过pH突变界面时，会因解离度变化而发生迁移速度乃至迁移方向突变，产生堆积现象。设电渗流向负极，我们从正极进样且样品区带的pH高于背景，则酸性样品会高速向后迁移并在区带后沿减速和集结，而碱性样品则向前加速，不能聚焦。如果样品区带pH低于背景，则酸性样品不聚焦而碱性样品向前减速，集结于区带前沿。,pH聚焦,对于两性组分，设样品区带pHpI而背景pHpI，则组分在区带中为负离子，它们向后（正极）迁移，进入背景后又变成正离子，再往回（负极）迁移，如此往复，紧密聚焦在区带后沿。若样品区带为低pH而背景为高pH，则样品离子向前迁移，聚结在区带前沿。凡向后聚焦的操作，最好在进样后，跟着再进一段背景缓冲液，以免区带跑出管口。利用pH聚焦可使两性组分的检测灵敏度提高两个数量级以上而效率保持不变。,色谱浓集,利用色谱原理让样品先在柱头吸着，而后进行在线洗脱分离，可以大幅度提高毛细管电泳的进样体积（至微升级）。有三类在线柱头浓集方法：涂层法，即在进样端键合一段色谱固定相，此法流动阻力小、易于操作，但浓缩量有限；填充法，即在管头填充色谱填料，其优劣与相反，注意，一旦填充处被堵，就需切去重装；拼接法，即将填充好的色谱小柱拼接到毛细管头上，本法可使进样量达到10l以上。拼接法亦有多种，建议将色谱填料充填在内径等于分离管外径的塑料管中，这样只须将分离管插入填好的小柱中即可，能随时更换。,检测条件,一般地，检测条件的选择包括检测方法、检测方式及有关参数选择等。毛细管电泳可以有柱上和柱后两种检测方式，除与质谱和核磁联用外，商品仪器通常采用柱上检测方式，没有多少选择的余地，所以检测方式的选择主要是针对自己组装的毛细管电泳系统。光吸收或发射型检测手段，通常采用柱上检测方式；电化学等检测手段，宜采用柱后检测方式。,检测条件,毛细管电泳检测方法的选择也比较有限，商品仪器中通常只有紫外吸收检测方法，有些厂家如Beckman与Agilent等出口的仪器还配有激光诱导荧光检测器，也可以和质谱联用。由于激光诱导荧光具有极高的检测灵敏度，所以只要有条件，就应当尽量选用它。不过，激光诱导荧光检测系统比较昂贵，而且通常需要对样品进行衍生方能实现检测，所以大家还是普遍采用紫外检测方法。,检测条件,紫外吸收是一种相当成熟和可靠的检测方法，有单波长、多波长、可变波长和波长扫描或二极管阵列等不同形式的检测设计，它们各有优劣：二极管阵列或波长扫描可以测定分离峰的紫外吸收光谱，用于组分定性和纯度鉴定，但检测灵敏度相对较低；可变波长检测器，能提供各种不同的波长，以获得选择性检测，但检测光线的能量一般较弱，灵敏度居中；多波长或单波长仅能提供有限的波长，但检测灵敏度高。,检测条件,在多数毛细管电泳中，使用200nm或205nm附近的检测波长，能对绝大多数的样品提供高灵敏度的检测条件。如果毛细管中填有凝胶，则检测波长需选在210nm以上，否则会因背景太强而测不出峰。紫外波长选择参数可参见表27,P64。,分离介质选择,分离介质的选择包括缓冲试剂、添加剂、溶剂、pH、试剂浓度、筛分介质、分配相等的选择与优化。这些参数的优化与分离模式有关。现以CZE介质的选择为重点进行介绍，在此基础上扩充介绍其他各模式介质的选择。,毛细管区带电泳介质选择,毛细管区带电泳是CE中最基本的方式，其介质的选择与控制也是其他分离模式的基础。毛细管区带电泳介质实际上是一种具有pH缓冲能力的均匀的自由溶液，通常称为电泳缓冲液（Runningbuffer）,简称缓冲液（Buffer）,由缓冲试剂、pH调节剂、溶剂和添加剂组成。缓冲液的选择，可分为pH与缓冲试剂选择、添加剂选择等部分。,pH及其缓冲试剂,缓冲体系由缓冲试剂和pH调节剂两部分构成，其中缓冲试剂的选择主要由所需的pH决定，而pH则依样品的性质和分离效率而定。PH的选择是决定分离成败的一大关键。若样品的解离常数已知，可用公式进行计算，使组分间em差别最大时所对应的pH就是理论最佳pHm。凡pKa=pHm1、em与样品接近、无紫外吸收的化合物均可视为候选缓冲试剂。对候选缓冲试剂进行实验测定，通常就能选出最佳试剂。,pH及其缓冲试剂,计算方法显然很吸引人，但实际样品的解离常数大多未知，做不了计算。此外，pH除控制弱电解质样品的有效淌度外，还控制着电渗甚至样品在管壁上的吸附水平，这就难以计算了。如此，就必需通过实验的搜寻和优化来选择最佳pH。可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.513），但电导也比较大。毛细管电泳中常用的缓冲体系还有硼酸或硼砂等，详见表28，P65。,pH及其缓冲试剂,研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH2）或碱性（pH9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=911之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=59之间选择分离条件。,pH及其缓冲试剂,pH的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在4pH9的范围以外工作，其涂层容易水解失效。,pH及其缓冲试剂,在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。我们的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。,pH及其缓冲试剂,与缓冲试剂一样，pH调节剂也会显著影响分离效率。由于多数缓冲试剂属酸性物质，所以pH调节剂主要是碱类，常用的有KOH、NaOH、Tris等。如果这些碱不能给出理想的分离结果，则可以考虑使用胺或醇胺等有机碱，它们本身可以作为缓冲试剂（表29，P66）。若缓冲试剂为碱类，则对应的pH调节剂即为酸，建议尽量采用弱酸。,pH及其缓冲试剂,缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10200mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。,添加剂,如果缓冲体系各种参数经优化后仍不能给出良好的分离结果，就应该考虑使用添加剂。最简单的添加剂是无机电解质如NaCI、KCI等。较高浓度的电解质可以压缩区带，甚至抑制蛋白质等分子在管壁上的吸附。不过，高浓度电解质容易导致过热，使分离效率反而下降。过热严重时，管内会出现气泡，分离不能进行。用两性有机电解质代替无机电解质可克服过热问题。在pH=pI时，两性电解质净电荷为零，不参与导电。实验证明，两性电解质是分离蛋白质的有效添加剂。,添加剂,还有三类重要的添加剂，一是非电解质高分子添加剂，如纤维素，聚乙烯醇、多糖、TritonX-100等等；二是荷电表面活性剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基季铵盐等；三是功能性添加剂，如手性冠醚、环糊精、二胺、动态网络形成剂等等。这三类添加剂主要通过分子间各种复杂的相互作用，影响样品的权均淌度。,添加剂,在功能性添加剂中，手性添加剂主要针对手性分离，在第七章中将有专门讨论。环糊精及其衍生物是主要的手性拆分添加剂，此外还能够破坏神经节苷脂等形成的混合胶束，使之产生电泳分离；二胺类常用于电渗控制或抑制蛋白质吸附；动态网络形成剂如纤维素、聚氧乙烯等能产生筛分效果，稍后再来讨论。,添加剂,表面活性剂具有吸附、增溶、形成胶束等功能。低浓度的阳离子表面活性剂，如十六烷基季铵盐，能在石英毛细管表面形成单层或双层吸附层，常用于电渗控制或用于抑制蛋白质在管壁上的吸附。阴离子表面活性剂如SDS能使蛋白质变性，在蛋白质分子量测定时很常用。高浓度的表面活性剂能形成胶束，可作为色谱准固定相。,添加剂,高分子类添加剂可以形成分子团或特殊的局部结构，从而影响样品的迁移过程，改善分离。高分子也可以强烈吸附在毛细管壁上，影响电渗以及分离过程。由于此类添加剂种类繁多，正是改善分离大有文章可做的地方，但也是最难掌握的部分。,溶剂,CE缓冲液一般用水配制，改用水-有机混合溶剂（少量的有机溶剂也可以看成为添加剂），常常能有效改善分离度或分离选择性，并使许多水难溶的样品得以用毛细管电泳分析。常用的有机溶剂主要是挥发性较小的极性有机物，如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲酰胺等。在极端情况下，可完全使用有机溶剂，或以有机溶剂为主体，这就是非水毛细管电泳技术。理论上，非水溶剂选择的余地很大，但实际上，由于受电解质溶解能力和强紫外吸收的限制，可选的有机溶剂并不很多，目前常用甲醇、甲酰胺和乙腈等溶剂。,毛细管凝胶电泳与非胶筛分介质选择,毛细管凝胶电泳实际上是一增加了凝胶支持介质的区带电泳，因而其介质的选择包含缓冲体系和凝胶体系两类。CGE所用的凝胶主要是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。凝胶支持介质主要依据样品的尺寸或大小来选择，在分离DNA小片断或进行DNA测序时，通常使用T=5%10%之间的交联或线性聚丙烯酰胺凝胶。在分离大片断DNA、双链DNA或某些蛋白质时，需采用琼脂糖凝胶。表30，P68列出了不同样品种类和分子量范围的凝胶参考选择方案。,毛细管凝胶电泳与非胶筛分介质选择,由于在毛细管中灌制凝胶介质有很大的难度，近年来，国际上发展出了新的筛分介质，即非胶筛分介质。它们主要是一些亲水线性或枝状高分子，比如线性聚丙烯酰胺、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇等。这些物质溶解于水中后，当浓度大到一定值时会自动形成动态网络。将不同聚合度的聚乙烯醇进行组合，能够构建出适合于DNA测序用的介质。结合使用SDS，利用不同浓度的纤维素组合，可以进行蛋白质分子量的测定。关于非胶介质体系的选择，目前尚无明确的规律，只能通过对不同种类、浓度和配比效果的研究比较，才能确定。,毛细管凝胶电泳与非胶筛分介质选择,CGE缓冲液的选择，由于受凝胶介质对pH的限制，可变性远小于CZE。典型的缓冲液种类及其组成请参见表31，P69。当使用非胶筛分介质时，缓冲液的选择和CZE没有差别，实际上，此时的筛分网络对应于CZE中的添加剂。,胶束电动毛细管色谱介质选择,本模式是CZE的缓冲液被高于胶束临界浓度的表面活性剂所修饰的结果。长链烷烃阴阳离子表面活性剂易在水中聚成球形胶束，电荷朝外，烷基藏于内部。其作用类似于色谱固定相，称为准固定相。显然表面活性剂的种、性质及浓度是MEKC条件选择的关键之一。,表面活性剂选择原则,表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、两性离子型和中性分子等不同种类（参见表32）。原则上凡能在水或极性有机溶剂中形成胶束的物质，都可用于MEKC，但是在实际工作中，由于毛细管电泳分离及其检测等方面的限制，可选的表面活性剂数量相当有限，目前比较常用的几种表面活性剂列在表32，P70。,表面活性剂选择原则,表面活性剂的选择应考虑以下限制：经济易得；水溶性高者为佳；紫外吸收背景越低越好；不与样品发生破坏性作用；所形成的胶束需有足够的稳定性；中性样品需选择离子型表面活性剂。,表面活性剂搜寻策略,根据上述原则，碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象。在实际工作中，由于SDS容易获得且紫外吸收较低，通常被首先选用。当其效果不好时，再换用具有不同碳链长度或结构的其他阴离子表面活性剂。若还得不到好的结果，就应该考虑使用其他类型的表面活性剂了。,表面活性剂搜寻策略,必需注意，阳离子表面活性剂可能会改变电渗方向，即从负极流向正极，此时需要反向进样电泳，在正极一端检测，得出峰顺序相反的谱图。,胶束修饰及其他,通过添加重金属离子可以改变胶束表面的电荷数量，进而改变分离选择性；使用混合表面活性剂，可以调节分离度或峰分布；在表面活性剂中加入手性中心，则可对光学活性分子进行选择分离。除表面活性剂所形成的胶束相外，还可以设法增加其他的作用相，比如另一种胶束（不同于由混合表面活性剂所形成的单相胶束）。,胶束修饰及其他,MEKC中比较经常采用的多相体系是：水-胶束-环糊精，这一体系容纳了相分配和超分子化学原理，在分离光学异构体以及两亲性分子时，很有用处。MEKC中的缓冲液选择和CZE基本相同。,微乳液毛细管电动色谱,MEEKC所用的微乳液是一种光学透明和热力学稳定的水包油（O/W）型分散体系，通常由缓冲溶液、不溶于水的有机液机（油）和乳化剂构成。缓冲液的选择原理同CZE。有机液体有丁烷、戊烷等。乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂。通过改变油和乳化剂的组成，可以改变峰容量、分离效率和分离选择性。,毛细管电动色谱,CEC可以看成是CZE中的空管被色谱固定相涂布或填充的结果，也可以看成是微色谱中的机构泵被“电渗泵”所取代的结果，所以CEC的介质选择是CZE和液相色谱的综合或交叉。毛细管电色谱的介质首先是固定相和柱子的选择，其次才是流动相或缓冲液的选择。根据固定相的特性（正相、反相等），缓冲溶液可以是水溶液或有机溶液。固定相的选择主要依据HPLC的理论和经验。目前，反相毛细管电色谱研究最多，可利用表33的起点条件开展研究。,毛细管电动色谱,由于毛细管填充柱的制备需要专门的技术，频繁更换固定相的机会比较小，所以主要考虑淋洗液的选择。淋洗液的选择因素包括淋洗强度、导电大小、pH、散热能力、背景吸收等，因此原则上是CZE和HPLC的合并。不过，开管电色谱模式与CZE更为接近，其差别主要在于毛细管的涂层。,毛细管电动色谱,有一点必须特别注意，那就是填充毛细管非常容易产生气泡，要设法予以消除。目前有两类消除办法，一是在毛细管两端施加压力（6kg），二是向缓冲液中通入某些特殊的气体如氦气等。,亲和毛细管电泳,当在CZE缓冲液或凝胶或色谱固定相中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。,等电聚焦,等电聚焦实际上是pH梯度CZE，正是因为要构建pH梯度，所以电