实验二 孚尔根核染色.ppt

医学遗传学实验,实验2洋葱根尖孚尔根染色法,实验目的实验原理实验方法注意事项实验作业思考问题,实验目的,掌握孚尔根核染色的方法。了解孚尔根染色的原理。,实验原理,Na2S2O3+HCl亚硫酸根亚硫酸根+碱性品红无色的亚硫酸品红Schiff试剂DNA在60，1mol/LHCl作用下，核酸中的嘌呤碱很快完全除掉，脱氧核糖中潜在的的醛基获得自由状态，水解条件下形成半缩醛羟基，与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物。,孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好，易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻）效果较差。,实验方法,水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50乙醇和清水分别冲洗,再把它放入室温的1mol/LHCl中处理2-3min。将根尖换入60预热的HCl，置于恒温水浴中，在600.5的条件下水解10min。吸出热HCl，换入室温1mol/LHCl再处理2min，然后水洗2-3次。吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条件下染色30min或过夜。,小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。漂洗液配置方法：取10ml10%亚硫酸氢钠母液，加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂洗液，使用前配置。蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。,固定与固定液,固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态结构的一种手段。,固定的目的,迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前状态。使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便于鉴定、观察。使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。,预处理的目的及方法,目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。方法：0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。对二氯苯饱和溶液3-5小时。0.002M(或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以上，室温。低温：1-4处理24小时。,HEXIUNIVERSITY,根冠,分生区,伸长区,成熟区,根尖形态与结构,注意事项,Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂的吸管。黑暗条件下染色。,实验作业,绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。,前期、中期、后期、末期,为什么要严格掌握DNA的水解条件？,温度过低，时间过短：则DNA的水解不够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。温度过高，时间过长：则DNA过度水解，游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成染色浅或不均一。,材料从60的盐酸倒出后温度还相当高，如果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff试剂分解。,为什么要在实验材料从60盐酸中倒出后，再放入室温的盐酸中呢？,为什么RNA在