实验三,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,一、目的,掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。了解电泳技术的一般原理。,二、原理,带电质点向着与它所带相反电荷的电极移动的现象称为电泳。带电质点之所以能在电场中向一定的方向移动，并具有一定的移动速度，是取决于带电质点本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH等因素。蛋白质分子在溶液中的电泳是由于蛋白质的分子具有一些自由的可解离的基团如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某种pH值溶液中蛋白质分子就带有一定的电荷。一个混合的蛋白质样品由于各蛋白质的等电点不同，在相同的pH溶液中所带的电荷性质不同，电荷的数目不同，在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得到分离。,血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见下表），在电场中移动速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH7.0所以在缓冲液（pH值8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称白蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白等电点（pI）4.885.065.065.126.857.50相对分子量/Mr6900020000030000090000150000156000300000,在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳，是以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如：丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后，涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后则成为醋酸纤维薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为120m。,醋酸纤维薄膜电泳是近几年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离及测定方面。三、器材1、醋酸纤维薄膜(28cm)2、常压电泳仪3、点样器(市售或自制)4、培养皿(染色及漂洗用)5、粗滤纸6、玻璃板7、竹镊,四、试剂1硼酸缓冲液（PH8.6,离子强度0.075mol/L）硼酸5.6025g，四硼酸纳5.6099g，氯化钠1.3163g，加蒸馏水至1000mL2染色液300mL含氨基黑10B025g，甲醇50mL，冰醋酸10mL,水40mL(可重复使用)。3漂洗液2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。4.透明液(现用现配）无水乙醇:冰醋酸7:3,五、操作1浸泡用镊子取醋酸纤维薄膜1张（8*2cm），识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上点样线（膜条一端1.5cm处，用铅笔横画一条线）放在巴比妥缓冲液中浸泡20分钟。整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜),2点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)。取一滴样品（血清）放置在载玻片上，用盖玻片的一端截面（玻璃宽度应小于薄膜的宽度），沾适量的样品（样品吸附高度约1-2mm，高度均一。），然后将其截面与薄膜上点样线处轻轻水平地落下并随即提起，样品呈一条线“印”在薄膜上，使样品尽量点得细窄而均匀，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。,3电泳在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将将点好样的薄膜(无光泽面朝下)两端平悬于电泳槽支架的滤纸桥(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥，它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。)上。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。平衡10min后，通电。调节电压至160V，电流强度0407mAcm(毫安厘米)膜宽，电泳时间约为60分钟。,4染色电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5漂洗将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次（3-4次，每次5min）至无蛋白区底色脱净为止，用滤纸吸取多余液体，可得色带清晰的电泳图谱。6.透明将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23min后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。,六、注意事项1、保持醋酸纤维素薄膜的清洁，避免用手直接接触薄膜。2、点样量要适宜，2次左右即可，盖玻片的边缘应避免出现明显液滴。点样要尽量点在一条直线上。（此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样。）3、电泳时间不低于1小时。4、点样处不要搭在滤纸上，以免血清渗入滤纸。5、醋酸纤维素薄膜应绷直，避免电泳槽隔离板的干扰。6、不可同时接触正负极，防止触电。,结果分析：,1、区带不分离，没有出现理论上的5条带。原因：电泳时间不够，电压偏低，点样量过多。2、区带不清晰，颜