《ELISA使用方法》PPT课件

免疫酶技术,基本原理,免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。免疫酶技术：是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。,实验一：ELISA方法检测人血清中IgG,酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosor-bentassay,ELISA）是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺。常用的方法：间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。,双抗体夹心法：用于检测特异抗原。将已知抗体包被固相，加入待检标本，标本中含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，加底物显色。,目的：*掌握ELISA技术*检测血清中IgG含量材料：抗人IgG抗体（羊抗人IgG抗体）（一抗）已知IgG含量的参考蛋白（作标准系列）待检人血清辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（二抗）包被液：PH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液洗涤液：PH7.40.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2终止液：2mol/LH2S04酶标反应板（一排/人）,操作步骤,包被（用一抗包被）（已做）洗涤3次(将洗液加入每孔，3min后倾去)加样：将已知含量的参考蛋白IgG倍比稀释7孔，第8孔加待检血清，第9孔加阴性血清第10孔作空白对照（100ul/孔）。,100ul稀释液,待测血清,PBS-T20,100ul标准品,100ul,100ul,孵育（3740min）洗涤3次加酶标记的抗人IgG抗体（即二抗）(100ul/孔)孵育（3740min）洗涤3次显色（加底物溶液，100ul/孔。室温避光15-30min）终止反应检测(490nm波长下检测),结果观察与分析：空白对照应无色；阳性孔呈棕黄色，标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度；绘制标准曲线。注意事项：做倍比稀释时，应从高浓度到低浓度；显色时一定避光；检测时应避免孔中有气泡。,实验二,APAAP法检测淋巴细胞亚群,原理：用抗人T细胞CD的McAb与T细胞的反应，用羊抗鼠IgG搭桥，其中一个Fab段连接抗T的McAb，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断CD分子的存在，从而确定T细胞的各亚群。优点：*不经化学交联反应，避免了抗体和酶活性降低。*省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。*标本易于检测，保持时间长。应用：*淋巴细胞分化抗原；*活化抗原；*MHC-、类抗原表达的检测。,APAAP法检测淋巴细胞亚群示意图,目的：T细胞亚群检测材料APAAP试剂盒（含CD3、CD4、CD8McAb）TBS缓冲液Mayer苏木精复染液纯丙酮鼠抗人T亚群单克隆抗体（一抗）羊抗鼠IgG（二抗）,操作步骤,1分离PBMC，PBS调整PBMC浓度。（已做）2甩片，固定，干燥，标记。（已做）3.加一抗（鼠抗人）10ul。37湿盒孵育，30min；PBS洗3次，擦片4.加二抗（羊抗鼠）10ul。37湿盒孵育，30min；PBS洗3次，擦片5.APAAP复合物10ul（鼠抗AP）.37湿盒孵育，30min；PBS洗3次，擦片6碱性磷酸酶底物显色，37湿盒孵育，30min；PBS洗3次，擦片7Mayer苏木精复染1min，自来水冲洗8高倍镜下观察,结果观察：阳性细胞：细胞膜上或胞浆着色为红色阴性细胞：细胞膜上或胞浆着色为无色计数阳性细胞百分率（100-200个）正常值：CD2、CD3阳性细胞：60-80%CD4阳性细胞