《EM原理与结构》PPT课件

第二章透射电镜的结构与成像原理,第一节透射电镜的结构,一、电子光学系统,二、真空系统,三、供电系统(电子学系统),电镜的组成(一）,电镜的组成（二）,高压电缆,电子枪室,第一、二聚光镜,光阑,样品臂,物镜,中间镜,投影镜,观察窗,荧光板,底片盒,TEM剖面图,观察室,（一）、电子枪1、电子枪结构1)自给偏压式三极电子枪阴极：尖端发射电子栅极：控制电子束形状和发射强度阳极：加速电子、调节电子波长,一、电子光学系统,电子枪典型结构的主要部件图,电子束形成示意图,灯丝加热温度和发射电流之间的关系,T,I,1、电子枪结构,2)场发射电子枪,阴极：钨丝针尖阴极，其曲率半径10002000。第一阳极：相对于阴极有一正压，引发阴极场发射并控制发射电流强度。第二阳极：加速电子、调节电子波长,场发射式电子枪,名词：场发射：在金属表面加上极强的电场之后，金属表面势垒降低,在隧道效应的作用下，金属内部的自由电子穿过势垒从金属表面发射出来，向真空飞去，这种物理现象称为场发射,场发射电子枪特点：亮度高；交叉光斑小，直径1m，最小30100；能量分散小；寿命长，给定寿命2000小时（实际可用3年左右）；分辨率高，高分辨率的TEM和SEM都采用。,1).钨丝阴极：热电子发射,最小交叉斑直径1050m,寿命2025h,最长约200h2).LaB6阴极：低温热电子发射亮度高,寿命约1000h,2、电子枪从材料可以分为：,1、磁透镜的汇聚作用2、汇聚作用结论：磁透镜总是汇聚透镜磁场稍有变化，焦距f则有较大变化,磁场强度越强焦距越短透镜的放大倍数越高。（焦度1/fHz2)，且电子加速电压越高，电子速度越快，电子越不被易折射，焦距f就越长,(二)、磁电子透镜,r,Fzr,几何光学作图法,1).聚光镜：汇聚电子束，控制束斑的大小控制孔径角第一级聚光镜C1：短焦距强磁透镜第二级聚光镜C2：长焦距弱磁透镜2).物镜作用：形成样品第一级放大的像;改变其焦距f，对象进行精确聚焦.类型：短焦距强磁透镜,3、TEM的磁透镜,3).与物镜相关的装置A.物镜极靴保证磁场的轴对称，防止磁饱和,减少磁场能量的浪费B.物镜可动光阑30，50，70m控制物镜孔径角、减小球差、增强像的反差C.物镜消像散器消除像散，提高物镜分辨率D.物镜的散热装置维持物镜低恒温，减少物镜热漂移,电子束,极靴,电磁线圈,电磁线圈,物镜极靴纵面图,带极靴的磁透镜,4).中间镜和投影镜中间镜类型：长焦距弱透镜倍率可变M20，可设二级作用：第二次放大图象、控制总放大倍数投影镜类型：短焦距强透镜，可设二级作用：第三次放大图象,总放大倍数：M总=MOMIMP其中：MO：物镜放大倍数MI：中间镜放大倍数MP：投影镜放大倍数物镜：ObjectiveLens(OL)中间镜：IntermediateLens(IL)投影镜：ProjectorLens(PL),物镜100X,样品,第一级实像,中间镜20X,第二级实像,最终像,投影镜100X,1）位置：聚光镜和物镜之间2）作用：更换样品，承载样品，移动样品3）组成：样品载体，样品架，样品台，样品移动机构，空气闭锁装置，防污染装置4）结构分类：顶落式：样品台在物镜激励线圈上方，样品架由上而下落入物镜中，稳定度高，可以获得高分辨率图像。侧插式：样品台在物镜激励线圈下方，样品架由上侧面进入物镜中，结构复杂可以获得最短物镜焦距，常采用,（三）、样品室,防污染装置,冷阱,铜块（-100-150C）,样品,入射电子,空心圆孔,观察装置荧光板（5070nm),散射反差为主小结构:（t50nm),位相反差为主特小结构:（d1nm,t10nm),唯一的反差：位相反差,4、提高反差的方法操作电镜缩小孔径角降低加速电压暗场观察离焦反差其中：（由卢瑟福散射定律推出）DN/N：被光阑挡掉的电子的机率Z：原子序数e：电子电量：孔径角V：电子加速电压M：样品原子量N0：阿伏伽德罗常数,dN/N=C*t即tdN/N从比较大的t值与很小的t值间,t越大,结论:dN/N越大,像的反差越强,dN/N=10,dN/N=5,dN/N=1,反差大,反差小,同理可得:越小，C越大，t稍有变化，dN/N就有很大变化，即dN/N越大、像的反差增大V越小，像的反差增大暗场观察,b,c暗场照明,离焦反差费涅耳环（条纹）：当光照射到一个障碍物边缘时，在该边缘会产生一个次级波，它与入射波发生干涉作用，在障碍物的边缘处产生明暗相间的干涉条纹。,费涅耳环：欠焦时亮线过焦时暗线正焦时消失故正焦时图象的反差最小,提高样品本身的质量厚度差别电子染色正染色，负染色超薄切片染色原则:生物样品不同区域不同组份对重金属离子的结合力不同,t越大,结合重金属离子越多;金属投影增加厚度（f1时：AB面正焦，CD欠：CD正，AB欠分类：残余像散（用消像散器消除），二次像散（清洗）消像散器的工作原理：在透镜磁场中，用消散仪产生一个弱的柱面磁场，并调节它，使之与要校正的像散大小相等、方向相反，从而抵消残余像散。,畸变：由于透镜边缘部分比中心部分的聚焦能力强，致使物体上各点像的放大倍数，随着物点离轴的径向距离的不同而变化畸变程度：(Rd)=CdR03分类：桶形畸变：Cd0,离轴越远，物点放大倍数旋转畸变：由于球差的存在使电子束角度随着离轴距离而变化扭曲畸变：（桶或枕）旋转注：畸变只是像的比例失调，图像是清楚的,色差：（波长差）定义：由于电镜加速电压波动导致电子束波长发生变化，使得入射电子速度不一致，与速度相应的电子波长也有一定的分散度，从而引起的一种像差。原理：V，电子越不易折射，焦距f大V，电子越易折射，焦距f小同理：（光镜）红光偏折最小，红光焦长紫光偏折最大，紫光焦短分类：中心色差，放大色差，旋转色差，放大旋转色差,形成色差的原因：f=Cc(V/V-2I/I)式中:f:焦差；Cc：色差系数V/V：加速电压相对起伏I/I：透镜激励电流相对起伏加速电压的变化透镜激励电流变化电子与样品的交互作用减小色差的方法：稳定加速电压和透镜激励电流106min，减小光阑直径（即孔径角）样品做薄，提高加速电压，使电子穿过样品的速度变化小。采用电子速度过滤器，减少参与成像电子速度分布,C.TEM最佳分辨率电镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率物镜的分辨率取决于：衍射差：d0.61/nsin=0.61/球差:sCs3色差、像散：可以忽略只考虑衍射差和球差的综合效应最佳1.1(/Cs)1/4opt=0.65(Cs3)最佳=0.2nm,实际(s2+d2+a2+c2)1/2一般TEM0.51nm（二）有效放大倍数：植物细胞直径100m动物细胞1020m细菌的直径1m病毒直径10100nm生物大分子110nm小分子0.11nm原子直径0.1nmM有效肉眼仪器,二透射电镜的其它性能指标,1.场深：也称景深，指在保持像清晰度的条件下，物面允许移动的距离。Dfi=/特点：场深大,可达1m容易聚焦，物面位置允许有Dfi长度的误差对于厚度小于场深的样品，都能获得高分辨率图像，尤其适合复型样品；但同时也导致图像上下叠加背底昏暗2.焦深：在保持像清晰度的条件下,像面许移动的距离Dfo=M2*Dfi特点：焦深大,M=500时，500m，最大可达10000m照相时非常方便,三适用于透射电镜的样品,1.从样品类别上分：超薄切片冷冻蚀刻的复型膜悬浮样品的滴片直接培养的单层细胞2.从研究内容上分免疫电子显微技术电镜放射自显影技术电镜细胞化学技术Xray微区分析,免疫电子显微镜技术的定义：(ImmuneElectronMicroscopy:IEM)又叫免疫电镜细胞化学技术，就是将免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来，研究抗原抗体相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作用具有较高的特异性，相互作用后，可直接形成或通过某种标记物形成大分子复合物或聚合物。该生成物具有电子致密性，在电镜下可以观察到，又不影响免疫反应的特异性。那么，就可以在细胞超微结构水平上或分子水平上研究免疫作用。这种在很高分辨本领电镜下非常精确地显示抗原所在位置的方法称为,免疫电子显微镜技术的原理：,用化学方法将不同大小的金粒与特异性抗体球蛋白在不影响特异性蛋白质免疫特性的前提下结合起来，制备成金标抗体(GA)。当GA与相应的抗原(直接法)或抗原抗体复合物(间接法)相遇时，即结合形成免疫金复合物，可用透射电镜观察反应结果：有金粒的地方，即为抗原或抗原抗复合物存在的地方。不同抗原肽以不同种动物供体来的相应标记抗体顺序反应，可在同一组织切片中标记两种抗原肽。抗体以小金粒标记，另一抗体以大金粒标记，在透射电镜下很容易将两者区分开来。两种抗原肽分别与来自不同种动物供体的抗体发生反应，兔初抗用小粒金标记的猪抗兔IgG检测；而豚鼠初抗IgG用大粒金标记的兔抗豚鼠IgG检测。,举例：,验证植物的胞间连丝组分中，是否有actin（肌动蛋白）和myosin（肌球蛋白）的存在。,VAP(6-nmgoldparticles)andMP(18-nmgoldparticles),Acoiled-coilinteractionmediatescauliflowermosaicviruscell-to-cellmovementLiviaStavolone,MariaElenaVillani,DenisLeclerc,andThomasHohnPNASApril26,2005vol.102no.1762196224,作业,1.名词解释：分辨率振幅差场深焦深透射电镜主要由哪三大系统组成?其中每个系统主要包括哪些部分?3.透射电镜工作时为什么要求真空?4.电子束与样品相互作用后产生哪些信息?其中又有哪些信息与透射电镜的成像有关？5.生物样品的反差有什么特点?怎样提高