分子生物学-DNA的重组与转座.ppt

第七章DNA的重组与转座,7.1同源重组7.2位点特异性重组7.3转座作用7.4逆转录转座子,广义上，任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗传重组（geneticrecombination）.狭义上，指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流，有时又称交换（crossingover）.通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性，从而为选择奠定物质基础。遗传重组包括同源重组，位点专一性重组，转座重组和异常重组。,7.1同源重组(homologousrecombination),一、定义：同源重组也称交换，指减数分裂过程中染色体间遗传物质的交换，即在两个双螺旋DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换。同源重组发生在DNA的同源序列之间。在生物细胞中很普遍，如真核生物非姊妹染色体之间的交换，姊妹染色体的交换，细菌及其某些低等真核生物的转化、转导、接合等都属于同源重组。,同源重组的机制,（一）、断裂复合：减数分裂中，染色体减数分裂和配对时，在染色单体水平上发生物理断裂，断裂可通过交叉重接而解除张力，从而产生两个相互重组的染色单体。,（二）重组过程:由Holliday提出，后经Messelson，Radding修改，可以分为以下几个步骤.1、切断（nicking）：同源联会的两个DNA分子中任意一个出现单链切口（由某些DNA内切酶产生）。2、链转换（stranddisplacement）：切口处形成5端局部解链，由细胞内类似于大肠杆菌DNAPolI的酶系利用切口处的3-OH合成新链，而把原有链转换出来，使原有链成为游离的5-单链区段。,3、单链侵入（single-strandinvasion）由链置换产生的单链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生的单链泡中。4、Loop切除：侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子中的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出来，由此产生D-Loop，其单链区随后被切除降解。5、链同化（strandassimilation）Loop切除中产生的3-OH断头和侵入的单链的5-P由DNALigase联接，同时侵入的单链沿5-3方向继续置换，Loop切除中产生的5-P断头。6、异构化：链同化过程中，DNA经过一定的扭曲旋转形成的异构体。7、分支迁移（branchmigration）：两条DNA分子之间形成的交叉点可以沿DNA移动，这一过程称为分支迁移。,图、分枝迁移,Holliday结构的拆分重组体连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接处为转换配对所形成交叉链的连接点称为Holliday结构。该结构中由二对连锁在一起的DNA分子组成。Holiday中间体的形成只完成了重组的一半，由于连锁在一起的两条DNA分子必须经过拆分（resolution）回复到彼此分开的双螺旋状态。拆分的方式有两种，需要内切酶在交叉点处形成一对切口，然后由连接酶连接。,细菌DNA的重组,1、细菌重组酶：1）RecA蛋白：为E。coliRecA基因的产物，RecA蛋白是催化重组基本反应的酶，能通过碱基配对使两个DNA连接成杂交分子。2）RecBCD酶：亦称核酸外切酶V，它通过Chi序列识别靶位点。该酶具有多种活性，可以在单链结合蛋白的存在下松开DNA双链，同时还具有ATP酶活性，它在重组中的作用是提供具有3-末端的单链区域。3）ruvABC：其中ruvA和B基因产物可促进异源双链结构的形成。,1、单链摄入和链交换RecA蛋白作用于DNA分子，用单链去置换双链分子的同源区段，这个反应称单链摄入。RecA蛋白的这种作用是通过与游离的单链3-端结合，并引导单链DNA侵入双链DNA中，这种作用还需要RecBCD的协助。E.coli中有一种ChiKai结构：5-GCTGGTGG-33-CGACCACC-5,RecBCD沿双链滑行至Chi结构附近时，将其附近的兔耳结构的一端切开形成具有3-端的单链区，RecA再与此单链DNA的3-端结合并引入另一双链结构中导致重组，RecBCD则沿双链继续寻找下一个Chi结构。兔耳结构：RecBCD结合DNA，使解链速度大于恢复双螺旋的速度，所以形成二个单链环，称兔耳结构。,同源重组的作用1、维持种群的遗传多样性2、在真核生物中同源重组使同源染色体的染色单体间发生物理连接，这样使第一次减数分裂时同源染色体能平均分配至子代细胞中。3、有助于DNA损伤的修复，发生重组的位置常含有错配的碱基。,7.2位点专一性重组,特指噬菌体DNA整合到细菌染色体DNA的过程。最早在phage的遗传学研究中发现的，DNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变为原噬菌体DNA的非活性状态（溶源状态）。在溶菌状态时，DNA以环状分子独立存在，两种状态的转换都与位点专一性重组有关。位点专一性重组不是由DNA序列的同源性所引起，仅涉及短的同源序列。整合和切除过程是在细菌DNA和噬菌体DNA专一的附着位点（attachmentsite,att）上进行的，,细菌的附着位点称attB，由序列BOB组成，噬菌体的附着位点称attP，由序列POP组成，其中O序列为attB和attP所共有，称为核心序列。重组就发生在这段序列上。在重组过程中DNA以线性形式插入细菌染色体，此时原噬菌体被重组产生的两个新的att（attL，attR）位点所固定，整合过程在attB和attP之间识别，而切除过程在attL和attP之间识别。,Figure.DoesrecombinationbetweenattPandattBproceedbysequentialexchangeorconcertedcutting?,Specializedrecombinationinvolvesbreakageandreunionatspecificsites,Figure14.21StaggeredcleavagesinthecommoncoresequenceofattPandattBallowcrosswisereuniontogeneratereciprocalrecombinantjunctions.,Specializedrecombinationinvolvesbreakageandreunionatspecificsites,Figure.RecombinationbetweentwopairedduplexDNAscouldinvolvereciprocalsingle-strandexchange,branchmigration,andnicking.,Specializedrecombinationinvolvesbreakageandreunionatspecificsites,Figure.IntandIHFbindtodifferentsitesinattP.TheIntrecognitionsequencesinthecoreregionincludethesitesofcutting.,Specializedrecombinationinvolvesbreakageandreunionatspecificsites,Site-specificrecombination:(位点专一重组）Antibodydiversity,HandLareallencodedbythreegenesegments:V,D,J,Enormousnumber(108)ofdifferentHandLgenesequencescanbeproducedbysucharecombination,Oneantibodyexampleproducedbysite-specificrecombination,7.3转座重组,同源染色体上的重组比例较少，较多的还是非同源染色体间的转座重组。原核生物，真核生物基因组中都有一些不必借助同源序列可以从一个部位移动到另一个部位的DNA片段，这些片段称转座子（transposonortransposableelement）。转座作用与供体和受体部位之间的序列没有任何关系。所有的转座子都有两个结构特征：其一两端有20-40bp的反向重复序列；其二转座子的中间具有编码转座酶的基因，这种酶催化转座子插入新的位置。转座子的共性：1、两端都有反向重复序列2、具有编码转座酶的基因，催化转座子插入新的位点,原核生物的转座（一）转座子的类型和结构特征1、简单转座子，即插入序列（insertionsequence,IS）。IS在大肠杆菌的质粒中很常见，如IS1有10个拷贝，IS可编码转座酶，是自主单位。5-GAC-CAG-3IS的共性：1、IS的末端为反向重复序列，15-20bp，二者可以不完全相同。2、IS转入宿主DNA序列时，使宿主DNA产生同向重复序列，靶位点长度一般为5-9bp，形成5-9bp的同向重复。,Transposition(转座作用）,ISelement,转座酶在宿主DNA上切割,IS插入缺口后形成同向重复,2、复合转座子：较大，由两个重复序列夹着中心区的编码其他蛋白如抗药性基因组成，通常以Tn命名。复合转座子的重复序列就是IS，可从一个位点转座到另一个位点，或从一个复制子转座到另一个复制子。（二）转座子的转座机制转座子都是具有编码与转座作用有关的酶转座酶，而转座子的末端大多数都是反同重复序列。其转座机制为：在转座酶的作用下，在转座子两端和靶位点产生切口，所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，然后由DNA聚合酶填补缺口，连接酶封闭切口。,转座作用的机制分为三种类型：复制型转座：留一个，转一个非复制型转座：直接转移保守型转座：为另一种非复制型转座，转座过程中，转座子从供体位点切除，插入到靶位点，其中每一个核苷酸都被保留下来。,Figure,Mu,transpositiongenerates,acrossoverstructure,whichisconvertedby,replicationintoa,cointegrate,.,1、Replicative,transposition,proceedsthrough,a,cointegrate,Figure,Nonreplicative,transpositionresultswhena,crossoverstructureis,releasedbynicking.This,insertsthetransposoninto,thetargetDNA,flankedby,thedirectrepeatsofthe,target,andthedonorisleft,withadouble,-,strandbreak.,2、,Nonreplicative,transposition,proceedsby,breakageand,reunion,Figure15.6,Nonreplicative,transposition,allowsatransposontomoveasaphysical,entityfromadonortoarecipientsite.This,leavesabreakatthedonorsite,whichislethal,unlessitcanberepaired.,Transpositionoccursby,both,replicative,and,nonreplicative,mechanisms,FigureBoth,strandsofTn10are,cleavedsequentially,andthenthe,transposonisjoinedto,thenickedtargetsite.,Nonreplicative,transposition,proceedsby,breakageand,reunion,.,（三）转座子转座频率的控制,对于细胞来说，控制转座子调换的频率是很重要的，为了自下而上，转座子必须能维持某一最小的移动频率，但是太大的频率会破坏宿主细胞，每一个转座子好像都有控制它自身调换频率的机制，机制的多样性通过Tn10被描写。,Tn10为复合型转座子，两端各有一重复序列5NGCTAGCN33NCGATCGN5IS10R是Tn10的活性组件，IS10L是功能缺陷型，其转座酶的活力是IS10R的1-10%，靠近IS10R有两个方向相反的启动子。,1、甲基化控制：Tn10上有二个甲基化位点（GATC），一个位于IS上，另一个位于转座子的转座酶启动子上。Tn10与宿主DNA一起复制时，产生半甲基化，转座子激活，编码出转座酶，导致转座，一旦两个位点均被甲基化，则转座酶停止合成，转座停止。,GATC,GATC,2、通过启动子调节：Tn10上有二个方向相反的启动子，向外的启动子较强，称Pout，转录产物为一短链RNA，向内的启动子Pin较弱，转录产物为一个有编码区段的RNA，可翻译出47KD的转座酶，两种转录产物RNA之间有40bp的重叠，可结合从而抑制转座酶的表达。,.,（四）转座子引起的某些遗传学效应引起插入突变插入位置上出现新的基因插入位置出现靶DNA的少数核苷酸对重复导致染色体畸变切除，转座子从原来的位点上消失。,真核生物的转座作用较清楚的是果蝇的P成分，玉米的Ac-Ds元件1玉米的转座成分玉米中存在几组控制元件：Ac-Ds，spm，Dt等，不同品系中其数目和位置不同。较清楚的是Ac-Ds元件，其中Ac是自主成分，Ds是非自主成分。Ac是一个,FigureTheAc,elementhastwoopen,readingframes;Ds,elementshaveinternal,deletions.,Controllingelementsinmaize,formfamiliesof,transposons,完整的转座子，长4563bp，可转录出3600bp的mRNA，含807个密码子序列，在编码序列两侧有11bp的反向重复序列，Ac具有转座酶基因，可以自主移动，它能引起较高回复频率的突变，Ac突变可导致玉米合成花色素苷。,Ds元件是在转座酶基因上有缺失的Ac元件，在Ac成分的激活下，Ds成分可以转座到新的靶位点，使靶位点处的基因失活，改变基因的表达活性，Ds突变能引起稳定的突变，产生无色的玉米粒。,2果蝇中的P元件果蝇中两个品系P型和M型杂交时，会出现：P雄+M雌后代不育P雌+M雄后代可育P品系中有P因子，M品系中无。P元件长度是变化的，但序列同源，最长P元件长约2.5Kb，有四个与转座作用有关的可译框（ORF）。P元件的两侧有31bp的反向重复序列，在靶位点上形成8bp的正向重复。,P元件在体细胞中，仅前两个内含子0、1可被剪切，外显子2和3不发生剪接，产生的mRNA为ORF0-ORF1-ORF2，编码66KD的蛋白，为转座酶的抑制物。P元件在卵细胞中，可剪切除去0、1、2、和3个内含子，将全部4个外显子剪接在一起，mRNA的翻译产物为87KD的转座酶，致命P元件发生转座，使配子细胞不育，导致后代不育。,在卵细胞中有细胞质，精细胞几乎无细胞质，卵细胞中早已充满了转座酶的阻遏物，固P品系的雌果蝇与任何品系的雄果蝇杂交，后代全都可育，而M品系中，由于卵细胞中无完整的P成分，也就无转座酶的抑制物，当其与P品系的雄果蝇杂交时，P成分被激活，表达出转座酶产生转座，导致配子不育，使后代不育。,逆转录作用（reversetranscription）,1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。,定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,7.4逆转录转座子,将从DNADNA的转移过程称转座，从DNARNADNA的转移过程叫逆转录转座。逆转录转座子特性：与高频自发突变有关；刺激寄主细胞基因组发生多种形式的遗传重排；插入单元两