《IH基本技术》PPT课件

免疫组化基本技术,第一部分组织与细胞材料的制备,内容：组织与细胞材料的取材和保存,主要内容一、人体组织标本的取材二、动物组织标本的取材三、取材注意事项四、细胞标本的准备五、组织的固定、脱水、透明和包埋六、切片七、组织与细胞材料的保存,概述免疫组织化学（Immunohistochemistry;IHC）技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。,一、人体组织标本的取材手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。,1.手术切除标本的取材：抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。,2.各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。,3.穿刺标本的取材：光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH）电镜（透射电镜、免疫电镜）,4.尸检组织的取材病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。,二、动物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。,动物处死方法：1.麻醉法乙醚或4戊巴比妥静注2.空气栓塞法3.断头法4.击头法5.股动脉放血法,三、组织取材注意事项1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。,2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小厚为0.10.3cm，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定,5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。,6.注意包埋方向7.边缘标记8.保持材料的清洁9.切除不需要的部分10.明确编号，登记11.骨组织还需脱钙,四、细胞材料的准备细胞的取材和制片法：1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定2030min。,优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背景染色。2.穿刺吸取法,3.沉淀法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。（1）常规细胞玻片制片法（2）单核细胞分离法,3.制备细胞玻片应注意（1）易脱片；（2）细胞应集中在直径0.61.0cm的圆圈内，总数105-106；（3）富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。,4.活细胞标本的制备法培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。,五、组织标本的固定1.目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。,（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。,（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,2.固定液的种类(1)甲醛固定液10福尔马林10中性福尔马林10中性缓冲福尔马林,(2)4多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液重铬酸钾25mg氯化汞10g冰醋酸50ml蒸馏水800ml,(5)ZamboniS液多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlPB液至1000ml(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。,(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸钾25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存备用，对核内抗原的保存效果较好。,(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。,3.固定方法的选择及注意事项(1)大小2cm2cm0.3cm(2)及时固定,(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)组织固定后必须彻底冲洗。,六、组织脱水、浸蜡及包埋1.目的由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。,2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。,3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油,4.原则脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。,5.常规石蜡包埋过程(1)脱水：75、85乙醇，95、乙醇，无水乙醇、。(2)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯,(3)浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡(4)石蜡包埋：修蜡块，标号,6.根据本实验室经验各种不同类型组织的石蜡包埋条件(1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间,75乙醇30120min，85乙醇30120min，95乙醇2h，95乙醇2h，95乙醇过夜，无水乙醇3060min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min，石蜡12h，石蜡23h。,(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h，1h，过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min,10min，10min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。,(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸蜡时间75乙醇30min，85乙醇1h，95乙醇1h，1h和4h或过夜，无水乙醇30min，12h和4h，二甲苯30min，30min和1h。,七、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。,1.切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。,(2)切片粘合剂的种类多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片丙酮5minAPES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml甲醛明胶液：40甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml,2.石蜡切片：3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机),4.切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)5260烤片18h。(3)切片厚24m。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4保存数年（石蜡切片）,(7)冰冻切片后需凉干后立即固定(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(9)冰冻切片固定后-80保存备用,八、组织与细胞材料的保存1.冷冻保存：-80，-145，-198组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。,2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管中，-80冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。,第二部分IHC的一些基本技术,主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法四、IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九、IHC常用缓冲液,一、实验的设计1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。,2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。,4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准6.预期达到的目标,二、石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。,二甲苯10min，二甲苯10min，二甲苯10min，无水乙醇2min，95乙醇2min，85乙醇2min，75乙醇2min，流水冲洗。,三、内源性酶的消除方法(一)内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液20min2.1H2O220min3.3苯肼溶液371h4.0.075%盐酸甲醇液30min,5.DAB-H2O2溶液中加0.005MNaN3过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min，经洗后1硼酸钠处理10min。7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸3060min。,(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法1.10醋酸10min2.0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0）20min3.1mol/L左旋咪唑20min,(三)内源性生物素的消除方法1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素2.先用25g/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。,四、IHC的非特异性染色1.特异性抗体不纯2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。3.IgG的交叉反应,4.共同抗原决定簇5.单一决定簇抗体的异质性6.特异性抗原弥散7.IgG受体干扰8.鼠源性抗体检测鼠源性组织,解决方法：1.用正常二抗血清吸附2.将组织用酶消化或抗原修复3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除4.高度稀释特异性一抗,五、酶消化和抗原修复1.为什么要进行酶消化和抗原修复？(1)固定液的影响自1893年FerdinandBlum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。,目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。,甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。(2)抗体制备的影响,2.酶消化(1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联,(2)蛋白酶的种类胰蛋白酶0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1NNaoH调pH至7.8。消化时间3730min。,胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时间3730180min。蛋白酶K20g/ml，用pH8.00.5MTris-HCI配制，消化时间372040min。,链酶蛋白酶0.1%，用pH7.4,0.5MTris-Hcl稀释，消化时间3714h。无花果蛋白酶0.1%浓度，用0.2MpH7.4PBS稀释，消化时间373060min。,菠萝蛋白酶其浓度为0.4%1，溶在0.01M，pH7.4PBS中，37消化30120min。尿素浓度3M37530min,(3)原则及注意事项胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值，消化温度、浓度和孵育时间。,3.热诱导的抗原修复：抗原修复(AntigenRetrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。,(1)依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120高温或强碱处理后，可使交联打开。,(2)修复方式：微波9610min2；直接加温100，15min；水浴锅100，15min；高压锅/消毒锅120，5min；真空加热10min；直接烤片法。,(3)修复介质：0.01MpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-12系列);0.01MpH7.0PBS;2%硫酸铝；2硝酸铝；生理盐水；蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。,(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：10020min；9040min；8060min；7020h。(5)选择最佳的修复方法,根据下表选择最佳的修复方法,柠檬酸BufferpH1-2Ph6Ph10-11Tris-HCLBufferpH1-2Ph7-8Ph10-11微波10010min2切片1切片2切片3压力锅12010min切片4切片5切片6微波或水浴锅9030min切片7切片8切片9切片10作阳性对照，不作任何处理,(6)AR应注意的问题：高温AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用AR后，却能很好地表达；,某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：,热处理后应注意自然冷却；热处理液不要让其煮干；不要任何抗原的检测都使用该方法；一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；,形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修复。,六、抗体的购置及注意事项1.抗体的购置目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。,2.购置抗体的注意事项(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体(2)能否用于石蜡切片(3)稀释度(4)特异性，交叉反应(5)用何种组织前处理形式(6)包装单位，价格,3.抗体的大致分类(1)癌基因与抗癌基因标记物；(2)细胞凋亡标记物；(3)各种信号传导标记物(4)各种正负调控基因标记物(5)细胞增殖及调控标记物；,(6)凝集素类标记物(7)激素受体标记物(8)病毒性标记物(9)各类肿瘤标记物(10)耐药基因标记物,七、抗体最佳稀释度的测定和保存1.直接测定法,一抗稀释度特异性染色非特异性染色1:50+1:100+1:200+1:400+1:500+()阴性对照()(),2.棋盘法,3.抗体稀释液抗体稀释液是从事IHC工作实验室必备，其制备方法如下：1克明胶(红、绿)溶在300ml0.2MpH7.6TBS中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，加入1克牛血清白蛋白和100mgNaN3，4保存。,4.抗体的保存商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在4中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10l/支分装，标上号，-40保存备用。用抗体稀释液稀释一抗可在4中保存一年。,八、显示系统及衬染剂的选择和配制(一)显示系统目前用于IHC的标记酶主要有HRP，AKP，其显示系统分别为：,1.HRP常用的发色基因：(1)3、3-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3-diaminbezidine;DAB);(2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);,(3)四甲基联苯胺；(4)盐酸对苯二胺；(5)4-氯-