《DNA复性动力学》PPT课件

DNA的复性动力学,DNA复性过程遵循二级反应动力学DNA复性过程中单链消失的速度用公式表示：-dC/dt=kC2,其中，C是单位时间的单链DNA的浓度,K复性速度常数,DNA序列的复杂性、初始浓度、片段大小、温度、离子强度,DNA复性的影响因素：,1/C-1/C0=Kt,-dC/dt=KC2积分,C/C0=1/(1+KC0t),当C/C0=1/2时的C0t值定义为C0t1/2,C/C0=1/2=1/(1+KC0t(1/2),即复性反应完成一半时,-dC/C2=Kdt,当t=0，C=C0,不同DNA的Cot(1/2)值不同，与K值相关DNA序列的复杂性影响K值:在控制反应条件（初始浓度、温度、离子强度、片段大小）相同的前提下，DNA分子的C0t(1/2)值，取决于核苷酸的排列复杂性。DNA序列的复杂性(complexity)X：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值。X=KCot1/2,AAAAAAAAX=1,ATCGATCGATCGX=4N105X=105,Cot(1/2)=1/K,复杂性X1,不同原核生物的Cot曲线,复性分数（1-c/c0）,Cot曲线：表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。相同核苷酸数量的DNA，复杂性小的DNA分子浓度高，复性快，Cot(1/2)值小，复杂性大的DNA分子复性慢，Cot(1/2)大。,原核生物Cot曲线的特点：形状相似（跨越2-3个数量级），Cot（12）不相同单一序列只是复杂性不同高度重复序列Cot(1/2)值小单一排列序列Cot(1/2)大poly(A)X=1Cot(1/2)=2x10-6T4X=1.7x105Cot(1/2)=0.3,不同原核生物的Cot曲线,P74图16,真核生物DNA复性曲线的模式图基因组为7X108复性反应分为三相，每相代表不同复杂长度的序列类型,Cot1/2,所占比例,复杂性X,重复频率,2重复序列(repetitivesequences),根据复性动力学研究将真核生物DNA序列归类：单拷贝序列轻度重复序列中度重复序列高度重复序列,1）单拷贝序列(singlecopysequences)又称非重复序列：一个基因组中只有一个拷贝。慢复性速度单一序列的复性曲线常只有一个拐点，而重复序列常有多个拐点。结构基因(蛋白质基因)大多是单拷贝序列。,单拷贝顺序在基因组占50-80，平均长度为13000bp单拷贝顺序储存了巨大的遗传信息。只有一小部分单拷贝序列编码蛋白质。,大部分结构基因位于非重复的DNA序列内,2）轻度重复序列(lightrepetitivesequences),在基因组中重复数2-10的重复顺序，为慢复性速度。少数在基因组中成串排列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。多为编码功能的序列,3）中度重复序列(moderaterepetitivesequences),基因组中重复数十至数万（105）次的重复顺序，复性速度快于单拷贝顺序，慢于高度重复顺序。多与单拷贝基因间隔排列。多为非编码序列，如Alu序列也有编码基因产物的，如rDNA、tDNA、组蛋白基因家族,一般往往以基因家族的形式组织。,rDNAgenefamily,Histonegenefamily,组蛋白基因家族,TS:可转录的间隔序列NTS:不转录的间隔序列,NTS,NTS,Alu家族：重复单位约300bp，由两个130bp重复序列及31bp间隔序列组成；重复30-50万次，分散存在；灵长类特有。约占人基因组的3-6。,真核生物的Alufamily,300,000copies广泛分布于非重复序列间,功能：可能参与hnRNA的加工与成熟。与遗传重组及染色体不稳定性有关。有形成Z-DNA的能力。可能具有转录调节作用。,还有许多其它家族如：Kpn家族、Hinf家族、多聚d-d家族等。,4）高度重复序列(highlyrepetitivesequences),在基因组中重复频率高，可达百万(106)以上，复性速度很快。序列一般较短，长10-300bp，如真核生物的卫星DNA。,卫星DNA序列(satelliteDNA),螃蟹,2,ATATAT.,果蝇,5,ATAATATAAT.,老鼠,9,GAAAAATGAGAAAAATGA,重复碱基数序列,特点：高度重复序列，重复单位由2-10bp组成，成串排列，重复数以百万次106。,卫星DNA：这类高度重复序列的碱基组成不同与其他部分，浮力密度也不同，用等密度梯度离心法可将其与主体DNA分开。,真核基因组DNA中的G:C碱基对的分布与细菌不同，是不均一的，约4560的DNA中G:C碱基对含量较高，小部分的碱基对含量相对较低，由于有这种碱基组成分布的不均一，在等密度梯度超离心分离后，出现一个主峰和一、二个小峰，这种小峰对主峰而言尤似主峰的卫星，所以称卫星DNA，它是多种短重复序列的混合物。按照重复序列的长度将卫星DNA分成3类：卫星DNA小卫星DNA微卫星DNA,卫星DNA的分类,(1)卫星DNA：长串联重复序列，位于染色体上的异染色区域。(2)小卫星DNA重复序列(minisatellite)：中等大小的串联重复序列，位于染色体末端，或其他部位。高变小卫星DNA：重复单位之间的序列差异大，但是有一个核心序列GGGCAGGAXG,近端粒部位；端粒DNA：主要有六个串联重复单位组成TTAGGG,卫星DNA的分类,(3)微卫星(microsatellite,MS)或为简短串联重复(STR,shorttandemrepeats):由更简单的重复单位组成的小序列，一般为26个碱基重复，如(CA)n,(GT)n,(CAG)n等，(CA)n最为常见。在染色体DNA中散在分布，其数量可达五到十万,是目前最有用的遗传标记。,不同生物的非重复基因占基因组的比例差别很大；,原核生物无重复序列低等真核生物10-20%repetitivesequence高等植物80%高等动物50%,基因家族,1）基因家族（genefamily）：真核生物基因组中来源相同，结构和功能相关的基因聚集在一起形成基因家族。根据分布形式分基因簇和散布的基因家族：基因簇（genecluster）基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，分布在某一条染色体的特殊区域；它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质。如组蛋白基因家族聚集在第7号染色体长臂3区内。,Histonegenefamily,组蛋白基因家族,假基因（pseudogene）：具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以假基因是没有功能的基因，用表示。来源：一般认为是由mRNA反转录成cDNA，然后整合在基因组中,散布的基因家族（interspersedgenefamily）,概念：一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，各成员在序列上有明显差异。这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族。,两种亚基的编码基因分别形成两个不同的基因簇，并存在于不同的染色体上.,人类珠蛋白基因家族典型的,血红蛋白,珠蛋白,血红素,22不同的亚基由各自的基因编码,2)广义的基因家族,根据基因家族成员序列的相似程度分类：A经典的基因家族，家族成员序列有高度的同源性，序列一致，拷贝数高，非转录间隔区短而一致。B基因家族各成员的编码产物保守（大段的高度保守氨基酸序列）；只是DNA序列的相似性低。C基因家族各成员的编码产物之间只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列的相似性更低。D超基因家族，各基因序列之间无同源性，但其基因产物的功能相似。编码产物之间也无明显的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。,基因外的重复序列,即为无编码功能的重复序列1)串联重复DNA-卫星DNA(高度重复序列)2)散布的重复DNA,2)散布的重复DNA,重复单位不成簇，分散在染色体的各个位点上。A短分散片段B长分散片段,A短分散片段（shortinterspersedrepeatedsegments,SINES）,特点：长度约为300bp，与长度约1000bp的单拷贝顺序间隔排列。拷贝数可达10万左右。如人的Alu家族。,B长分散片段（longinterspersedrepeatedsegments,LINES）