禽白血病及鸡白痢净化

禽白血病及鸡白痢的净化,康昭风江西省农业科学院畜牧兽医研究所,一、禽白血病的净化,（一）、禽白血病简介（二）、禽白血病常见症状及病变（三）、江西省禽白血病流行现状（四）、禽白血病的净化技术,（一）、禽白血病简介,禽白血病（AvianLeukosisAL）是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirusALV）肉瘤病毒群病毒（AvianSarcomaVirusASV）引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病，临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征。,禽白血病病毒属于反录病毒科禽C型反录病毒群。禽白血病病毒与肉瘤病毒紧密相关，因此统称为禽白血病/肉瘤病毒。病毒粒子直径80145nm，在蔗糖中的浮密度1.1541.17g/ml。,禽白血病毒粒子结构示意图,ALV分为内源性病毒和外源性病毒。两种病毒的主要差别在于长末端重复序列（LTR）区的不同。外源性病毒可以是全基因型的病毒粒子，也可以是缺陷型病毒基因组和辅助病毒囊膜组成的伪型。内源性病毒即整合于宿主细胞染色体中的完整或缺失的前病毒DNA序列，具有很低或没有致瘤性。,禽白血病病毒的多数毒株能在1112日龄鸡胚中良好生长，可在绒毛尿囊膜产生增生性痘斑。腹腔或其他途径接种114日龄易感雏鸡，可引起鸡发病。外源性禽白血病病毒可在鸡胚成纤维细胞培养物内生长，但内源性禽白血病病毒则不能，可以以此区分内源性和外源性禽白血病病毒感染。,禽白血病/肉瘤病毒对脂溶剂和去污剂敏感，对热的抵抗力弱，对紫外线有相当强的抵抗力。病毒在-60以下可以保存几年，在-15时的半衰期小于一周，在pH59之间稳定，但超出这一范围，灭活率显著升高。,根据病毒囊膜蛋白和与病毒的宿主特异性相关的gp85蛋白抗原性差异，禽白血病毒可分为共10个亚群，其中只有、和亚群能感染鸡。最近，崔治中等在我国地方鸡中又分离到一个新亚群，确定为ALV亚群。,由于感染毒株的不同，禽白血病的临床症状及病理变化非常复杂，据此常分为以下几种类型的禽白血病：,1.淋巴细胞性白血病：最常见的一种病型。在14周龄以下的鸡极为少见，至14周龄以后开始发病，在性成熟期发病率最高。病鸡精神萎顿，全身衰弱，进行性消瘦和贫血，鸡冠、肉髯苍白，皱缩，偶见发绀。病鸡食欲减少或废绝，腹泻，产蛋停止。腹部常明显膨大，用手按压可摸到肿大的肝脏，最后病鸡衰竭死亡。,2.成红细胞性白血病通常发生于6周龄以上的鸡。临床上分为两种病型：即增生型和贫血型。增生型较常见，主要特征是血液中存在大量的成红细胞，贫血型在血液中仅有少量未成熟细胞。两种病型的早期症状为全身衰弱，嗜睡，鸡冠稍苍白或发绀。病鸡消瘦、下痢。病程从12d到几个月。,3.成髓细胞性白血病：临床表现为嗜睡，贫血，消瘦，毛囊出血，病程比成红细胞性白血病长。剖检时见骨髓坚实，呈红灰色至灰色。在肝脏偶然也见于其他内脏发生灰色弥散性肿瘤环节。组织学检查见大量成髓细胞于血管内外积聚。外周血液中常出现大量的成髓细胞，其总数可占全部血组织的75%。,4.骨髓细胞瘤病：全身症状与成髓细胞性白血病相似。由于骨髓细胞的生长，头部、胸部和跗骨异常突起。这些肿瘤很特别地突出于骨的表面，多见于肋骨与肋软骨连接处、胸骨后部、下颌骨以及鼻腔的软骨上。骨髓细胞瘤呈淡黄色、柔软脆弱或呈干酪状，呈弥散或结节状，且多两侧对称。,5.骨硬化病在骨干或骨干长骨端区存在有均一的或不规则的增厚。晚期病鸡的骨呈特征性的“长靴样”外观。病鸡发育不良、苍白、行走拘谨或跛行。,6.血管瘤：以鸡的皮肤和内脏器官表面形成血疱为特征的疾病。2006年由华南农业大学辛朝安教授首先报道在我国由J-亚型禽白血病病毒引起的血管瘤。近年来血管瘤在我国山东、河南、安徽、江苏、广西等地都有爆发报道。血管瘤造成蛋鸡产蛋率下降、生长迟缓、鸡群免疫抑制、鸡只渐进性死亡，死亡率有时高达10%20%，给我国养鸡业造成严重经济损失。,7、其它：肾瘤、肾胚细胞瘤、结缔组织瘤等，自然病例均极少见。,（二）、禽白血病常见症状及病变,禽白血病感染鸡只鸡冠苍白,肝肿大,肝脏有肿瘤结节,肾肿大,肝脏肿瘤结节,肌肉肿瘤结节,卵巢肿瘤,（三）、禽白血病感染情况,据我所在几个江西地方鸡品种的鸡场调查，这些鸡场都存在禽白血病。几个鸡场禽白血病蛋清P27抗原检测结果如下：A：49.6%，B：44.5%，C：36.3%，D：22.5%，E：32.5%，G:20.0%。,蓝色表示阳性，颜色越深，阳性越强,病原分离与鉴定,在上述其中两个鸡场中的鸡群中，采取血样，经DF1细胞培养，再经PCR鉴定，在三个鸡群中均分离到J-亚型禽白血病病毒，但未分到其它亚型的禽白血病病毒，也未分到MDV、REV等病毒。这说明在我省的鸡群中主要为J-亚型禽白血病。,1、2、3号样品均出现目的条带,2010年34月，江西部分养鸡场J-亚型禽白血病血清学调查结果见下表表1各鸡场ALVJ抗体ELISA检测结果鸡场代号品种检测样品数(个)阳性数(个)阳性率(%)A快大麻鸡父母代2428.33B快大黄鸡父母代1200C父母代蛋鸡1800D土杂鸡1800E商品蛋鸡2000,F快大青脚麻鸡父母代181055.6G江西地方黄鸡18316.7H土鸡29310.3I江西地方黄鸡2727.4J土杂鸡商品代20210.0K商品蛋鸡1400L父母代蛋鸡1500M商品蛋鸡12216.7合计245249.8,2011年有关报道,（四）、禽白血病的净化,1、净化的必要性,种鸡感染禽白血病后，主要表现为消瘦、鸡冠苍白，严重生长发育不良，发生机体免疫抑制，免疫反应低下，从开产到达到产蛋高峰前后的死亡率有的高达23%，产蛋率明显低于正常鸡的水平。感染禽白血病种鸡孵化出的后代，产生广泛的免疫抑制，导致均匀度差，死亡率高，饲料转化率低等一系列生产性能下降等问题。,据报道，P27抗原检出率与种鸡群的发病状况及其子代鸡群的发病状况和客户投诉情况密切相关，即种蛋中P27抗原检出率越高，种鸡群发病情况越严重，下游客户鸡群发病率和投诉率越高。种鸡群的种蛋P27检出率与种鸡群及其孵化后鸡群的禽白血病感染状况具有较好的吻合性，可以作为开展禽白血病的流行病学调查和感染风险评估的重要指标。,更为严重的是，ALV这种垂直传播疾病的感染率往往会逐代放大。这是因为蛋传病毒不仅在雏鸡出壳后就可能排毒，而且在刚出壳的雏鸡间特别容易发生横向感染，这种横向感染在孵化厅及运输箱中很容易发生。有报道表明，在装有80100只初生雏鸡的运输箱中，如果有1只雏鸡已经垂直感染ALV并排毒，在2448h内可使同一运输箱内30%的其它雏鸡被感染。,2、净化方案,方案A(国际金标准)对核心鸡群全部采血浆接种DF-1细胞，9d后检测p27抗原，几阳性者全部淘汰。分别在68日龄和168日龄至少做两次采血分离病毒。对保留的所有核心群种鸡的下一代所有出壳鸡，检测胎粪中的p27，淘汰所有阳性鸡。如此反复。,优点：检测特异性和检出率很高，如严格实施45年，就可能实现基本净化，此后只需采样监控，不再全面检测。要达到彻底净只有这个方案缺点：现在需要投入的资金、设备和人力较大，而且还没有足够数量的训练有素的有经验的技术队伍。,方案B基本原则：根据泄殖腔棉拭子及蛋清中P27抗原检测，阳性者全部淘汰。,优点：方法简单，成本相对较低，每次可检测所有个体样品。,缺点：不能区别内源性E群ALV，会把感染了内源性E亚群但是没有感染外源性ALV的鸡淘汰了。并且当阳性率高时，对选种不利，很难被育种专家接受。另一方面，单靠泄殖腔棉拭子蛋清中P27抗原检测，其灵敏度尚不足以检测出所有感染鸡。因此只能保持鸡群相对较高的洁净度，但不能完全净化。因而，检测和净化过程需不断进行。,适应情况：当整个后备鸡群p27阳性率在20以下或往育种专家可接受全部淘汰的范围时，可采取这一方法。,方案C将前两个方案结合起来。基本原则：将对棉拭子p27阳性和阴性鸡分开饲养，p27阳性鸡分别取血清或蛋清在DFI细胞上分离外源性ALV，仅淘汰外源性ALV阳性鸡。,优点：能区别外源ALV，仅仅淘汰外源性ALV阳性鸡，仍保留内源性ALV阳性鸡。,缺点：细胞培养，技术性高，人力成本、试剂成本及实验室装备较方案B显著提高，但明显低干方案A。,适应情况：当整个鸡群棉拭子或蛋清中p27阳性率超过20，内源性ALV淘汰过高影响育种而不能为育种专家接受时。或者说，在我国现在的条件，各相关的原种鸡群还没有条件按方案A实施净化时，这一替代方案是最合适的过渡阶段。,3、净化鸡群的饲养管理,（1）、经检测ALV阴性鸡群，应有一个生物安全隔离较好的无污染的场地单独饲养，不能与其它鸡群混养。（2）、避免人员、用具、设备等的交叉污染。（3）、种蛋即时收集并消毒。,（4）、最好建立家系，按家系孵化，出雏时每个家系、甚至每个母鸡的后代在相对隔离的出雏盒中出雏。如有条件应做胎粪检测ALVP27抗原，淘汰阳性家系。（5）、育雏期尽可能分家系饲养，以减少水平传播概率。（6）、疫苗注射尽量采取一鸡一针头或用无针头注射器。,（7）、疫苗应选用SPF鸡胚生产的，特别是活疫苗，如有条件，最好每批活疫苗做ALV检测。（8）、翻肛鉴别雏鸡性别时，避免交叉感染，工作人员要及时消毒洗手。（9）、鸡场采取“全进全出”饲养方式，便于消毒，减少交叉感染。（10）、人工授精时，一只母鸡一根输精管，防止人为传播病原。,4、净化实例,5、检测技术,目前主要用ELISA的方法检测禽白血病的P27抗原，但要做到彻底净化，还需用到细胞培养，由于细胞培养不仅需要大量的资金投入，技术人员也严重不足，因此我省当前的净化工作主要以ELISA方法为主。,（1）采样要求：检测次数的多少与净化进展有密切的关系，但由于检测成本问题，一般选择0日龄采集胎粪、810W、20W前后采集泄殖腔或阴道拭子样本。母鸡产蛋后采取头3只蛋的蛋清。,每次采集的胎粪样品或棉拭子样品要及时加入专用稀释液，置-20冻存，蛋清样品的采集方法是每只蛋采0.30.4ml的蛋清，加入EP管中，同一母鸡的蛋清放入同一EP管中混合，置-20冻存。,（2）、样品处理：胎粪样品及泄殖腔拭子样品需反复冻融3次，然后3000rpm离心2分钟，取上清液作为检测样本，蛋清也要反复冻融3次，每次解冻后用力摇匀。（3）、检测：严格按试剂盒说明书操作，注意作好标记。,6、检测所需设备,（1）酶标仪（2）酶标洗板机（3）纯水机（4）离心机（5）CO2培养箱（6）倒置生物显微镜（7）超净工作台（8）10万级无菌室（9）冰箱、温箱以及8头移液器等常规仪器,二、鸡白痢的净化,（一）、鸡白痢对鸡群生产性能的影响（二）、鸡白痢净化技术要求（三）、净化鸡群的管理,（一）鸡白痢对鸡群生产性能的影响,1、对蛋鸡和种鸡的影响：1.1产蛋率下降、死淘率上升。1.2种蛋受精率下降、孵化率降低。1.3初生雏弱雏增加、育雏率下降。,2、对肉鸡的影响2.1死亡率增加。2.2生长速度降低。2.3均匀度下降,（二）鸡白痢净化技术要求,1、检疫时间：分别在6070日龄、开产前一周、产蛋高峰后2周。2、检疫方法：用鸡白痢全血平板法或卵黄平板法。2.1全血平板法：鸡白痢全血平板抗原自冰箱取出后，平衡至室温（2025），在玻璃平板上分开滴3滴（约50ul）抗原，取待测鸡血液一滴、阳性血清、阴性血清各一滴，在平板上分别与抗原混合，2分钟内判定结果。,2.2卵黄平板法：可用卵黄代替全血，方法是打破鸡蛋，去蛋清，留下卵黄，刺破卵黄膜，用移液器取50ul卵黄与滴在玻木板上的抗原液迅速混合均匀，其余要求同全血平板凝集法。但用卵黄检出的敏感要低于全血。,2.3检疫操作注意问题：2.3.1检疫器材必须彻底清洗、消毒；做到每鸡一个塑料吸头，每鸡的血液量（或卵黄量）与抗原量大致相等并混合均匀。,2.3.2结果判定：抗原与全血（或卵黄）混合后在2分钟内出现明显蓝色颗粒凝集或凝集为片状的判为阳性，在2分钟内不出现凝集或仅呈现均匀一致的微细颗粒判为阴性。并应设阳性对照和阴性对照。,在现场检疫过程中，如因受鸡舍条件影响或抓鸡时有大量灰尘落在玻璃板上，使抗原和血样混合后，在边缘处若形成有细絮状物，也判为阴性。阳性鸡的判定直接关系到种鸡场净化的质量，所以结果的正确判定甚为重要，判定结果时应注意凝集反应要控制在2025下进行，并注意避免风吹和曝晒。,（三）净化鸡群的管理,1、鸡场的合理选址2、鸡场合理规划与布局3、饮水的卫生与消毒4、饲料的卫生5、种蛋的收集与消毒6、孵化场的卫生与消毒,7、鸡舍的卫生与消毒8、老鼠与苍蝇的控制9、人员进出鸡场的消毒10、用具的卫生与消毒11、鸡粪的处理12、鸡场的环境卫生13、引进种蛋、鸡苗或种鸡的检疫14、合理的用药和疫苗免疫15、全进全出的饲养管理制度,禽白血病和鸡白痢净化与非净化鸡群生产性能差异性,安徽省农业科学院畜牧兽医研究所对安徽省某地方品种鸡开展禽白血病和鸡白痢检测净化研究中，对获得的净化鸡群和非净化鸡群在死淘、产蛋、种蛋孵化以及后代生长性能等方面进行了观察比较。结果表明:,净化鸡群及其后代的死淘率较非净化组有较大程度降低；