《酶法分析》PPT课件.ppt

1,第七章酶法分析,2,酶是生物体内产生的、具有催化功能的蛋白质，是一种生物催化剂。,什么是酶(enzyme)？,3,来源不同酶来自生物体。酶是活细胞产生的蛋白质，能够在较温和的条件下进行催化反应，如常温、常压和中性的pH环境。目前，人们尚无法用有机化学方法合成酶分子。催化效率非常高比化学催化剂高1071013倍。,与化学催化剂相比，酶具有以下特点：,4,酶具有高度的特异性对其催化的对象(底物，substrate)有高度的选择性。通常将被酶作用的物质称为该酶的底物。一种酶只作用于一种或一类底物，酶催化反应几乎没有副产物，这就是酶的特异性。酶易失活酶与化学催化剂相比更脆弱。凡能使蛋白质变性的因素，如高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线照射均能使其失去催化活性。另外，对结合蛋白质一类的酶，若将其辅助因子(小分子物质或重金属离子)除去，酶也失去活性。,5,酶分析方法利用酶促反应的高度专一性与分析化学的研究思路相结合，所建立的酶分析方法，已经得到了广泛的应用。,6,5.1酶及酶催化的反应酶法分析基于酶催化的反应。酶活性及催化的反应受各种因素的影响，只有对它们的一般规律有了较深的理解，才能很好地控制酶催化的反应，以得到可靠的分析数据。,7,5.1.1酶活性的概念由于酶是一种蛋白质催化剂，它的催化活性易受环境因素的影响，在储存过程中会失活，所以一般很难得到非常纯的酶。对一般的化学试剂，其纯度一般在90100之间，而对于酶制剂，其纯度通常在15之间。酶通常很难用经典的单位，如质量、体积或物质的量浓度来表示。酶的量一般用酶活性单位或酶活力(Activity)来表示。,8,酶的活性单位(ActivityUnit)指的是在一定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的增加量。也即酶量的多少以酶的催化能力来度量，实际上是通过测定酶的催化反应的速度来表达。酶活力的测定是研究酶的特性，进行酶制剂的生产及研究其应用时的一项必不可少的指标。,9,1961年第五届国际生化会议采纳了IUPAC及国际生化协会酶委员会推荐的酶国际单位IU的定义：在特定条件下1min内将1mol的底物转化为产物所需酶的量，这样一个酶的量就叫1IU的酶。在报导酶的活性时应采用固定的温度(建议用25C)、pH和底物浓度。对于酶的制剂则常用每毫升或每升溶液中酶的活性单位(IU/ml；IU/L)来表示。,10,酶的比活性(SpecificActivity)又叫比活力，定义为每毫克酶蛋白所具有的催化活性，即IU/mg(蛋白质)。比活性越高，酶纯度越高或酶的活性结构保持得越好。用比活性进行酶制剂间相对活性的比较或酶制剂纯度的检测比较方便。,11,5.1.2酶催化反应的类型及酶的编号根据酶所催化的反应类型，可将其分为六大类，在每种大的类型下，根据参与反应的底物、辅酶或基团又可进一步分类。氧化还原酶(Oxidoreductases)转移酶(Transferases)水解酶(Hydrolases)裂合酶(Lyases)异构化酶(Isomerases)连接酶(Ligases),12,氧化还原酶(Oxidoreductases)亚类(表示底物中发生反应的供体基团的性质)包括：1.作用于供体的CHOH2.作用于供体的醛基或酮基3.作用于供体的HCCH4.作用于供体的CHNH25.作用于供体的CHNH6.作用于NADH或NADPH,13,转移酶(Transferases)亚类表示底物中被转移基团的性质1.转移一碳基团2.转移醛基或酮基3.转移酰基4.转移糖苷基5.转移甲基以外的烷基或芳香基6.转移含氮基团7.转移磷酸基8.转移含硫基团,14,水解酶(Hydrolases)(亚类表示被水解的键的类型)1.水解酯键2.水解糖苷键3.水解醚键4.水解肽键5.水解其他CN键6.水解酸酐键,15,裂合酶(Lyases)(亚类表示分裂下来的基团与残余分子间的键的类型)1.CC2.CO3.CN4.CS5.CX6.PO,16,异构化酶(Isomerases)(亚类表示异构的类型)1.消旋及差向异构酶2.顺反异构酶3.分子内氧化还原酶4.分子内转移酶5.分子内裂合酶,17,连接酶(Ligases)(亚类表示新形成的键的类型)1.CO2.CS3.CN4.CC5.磷酸酯键,18,酶的编号每种具体的酶的分裂编号都是由四位编码的数字组成，编号之前均冠以EC，例如：ECW.X.Y.ZEC是EnzymeCommision(酶学委员会)的缩写W指出催化反应的类型(16)X指出该酶是属于哪一个亚类，即指出与反应的一般底物及基团Y指出该酶属于哪一个亚-亚类，即指出催化反应特殊的底物或辅酶Z指出该酶在亚-亚类中的编号，即酶的系统编号(与酶被发现的早晚及来源有关)。例如：醇脱氢酶(EC)，第一个“1”代表氧化还原酶类；第二个“1”代表以CHOH基为供体的酶类；第三个“1”代表NAD或NADP为受体；第四个“1”则与具体的酶相关，它是同一类酶的顺序编号，一般与其发现的先后一致，先发现的序号排在前。,19,5.1.3酶催化反应的特性酶作为一种催化剂，它只加速反应的进程，而不改变反应平衡的位置。酶可以使反应至少加速一百万倍。,20,(1)活性中心的化学结构，它可以诱导致使底物的化学键变形或极化，其结果使底物基态的能量提高，因而具有更高的反应活性。(2)底物与酶的结合部位对底物的固定化作用，使底物与其它参与化学反应的基团接近，使底物分子进入酶的活性中心区域，因而使很多反应类似于分子内反应，这称之为接近效应(ProximityEffect)，其结果是大大提高了活性中心区域的底物有效浓度，使参与反应的基团的有效浓度非常高，因而比一般的分子间反应的速率要高得多。,酶的高效催化活性一般归因于以下四个方面,21,(3)使底物正确而有利的定向，这使得进行每一步反应时底物的键只发生最小程度的移动或旋转，因而使反应只需要最低的活化能，另外活性部位合适的电荷分布和有利的几何形状也是影响过渡态能量的两个因素。(4)多功能基因间的协同催化作用。酶的上述特性彼此不能分离，共同加速酶催化反应的速率，使酶成为最强有力的催化剂。,22,(1)活性部位仅占酶整个体积的一小部分，即酶分子中大多数残基并不与底物接触。(2)酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨基酸序列上不同部位的残基所组成。,酶的活性中心的特点,23,(3)酶的三维活性中心是裂缝或裂隙，常是一个疏水的环境，底物就存在于这样的一个环境中。有些氨基酸残基与底物的定向相关，因而与酶的特异性有关，而有些氨基酸残基则参与了催化反应，这些氨基酸也存在于活性三维实体的裂缝中。(4)底物与酶之间是以一种弱的力结合在一起的，二者复合物的平衡常数可在10-2108mol/L的范围内变化，对应的相互作用的自由能的变化在-12.5-50kJ/mol.(5)结合的专一性取决于活性中心中原子的确定排布方式,24,5.1.4酶催化反应的动力学,反应速度随底物浓度S变化的曲线,25,对于酶反应，其反应动力学的预测是非常复杂的。但在研究底物浓度对反应速度的影响时，总是得到如上图所示的实验结果。当底物浓度升高时，最初底物的浓度与反应速度成正比，这属于一级反应；当底物的浓度升高到一定的程度时，反应速度不再随底物浓度的增加而增大，这时变成零级反应。对这一实验事实给出最为合理的解释是酶催化反应速度依赖于酶(E)底物(s)复合物分解形成产物的速度。,26,由此可以看出，反应产物的形成只包含一个组分，即ES复合物(中间产物)，此中间产物可看作是相对稳定的过渡态物质，它进一步分解为产物P和游离态酶E。当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成止比。因而反应表现为一级反应。而高浓度的底物会饱和所有酶的活性位点，使ES复合物的浓度为最大，因而表现出最大的反应速度。底物浓度再增加时并不能提高ES复合物的浓度，因而反应速度将保持不变，此即零级反应。,27,米氏方程,这个方程式概括了前图给出的动力学特征。当底物浓度低时，S比km小得多，vSvmax/km，这就是说，反应的速度与底物的浓度成正比；而当底物浓度很高时，S比km大得多，所以v=vmax，这就是说，反应速度已达到最大值，不再随底物浓度的增大变化了。当然，当S适中时，反度表现为混合型即介于零级与一级反应之间。,其中，,28,km和vmax的重要意义米氏常数km是酶的特征常数之一。它一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶，km值不同。但如果一种酶有几种底物，则对每种底物，各有一个km值。km值不仅与具体底物有关，也与测定时的条件有关，如温度及离子强度等。因此，酶的km值可以作为鉴定酶的一种手段，但测定必须在指定的条件下进行。,29,5.1.5影响酶催化反应的因素影响酶催化反应的因素众多，除了酶和底物的性质，还应该考虑酶的活性、底物的浓度、激活剂与抑制剂、温度、酸度等。在讨论影响酶促反应的因素时，有两个前提：一是采取单因子研究法，即固定其它因素不变；二是讨论酶促反应的初速度，因为此时的反应速度与酶的活性成正比。,30,温度对酶催化反应的影响,pH对乳酸脱氢酶活性的影响,31,5.2酶法分析的检测技术,在酶法分析中，被分析的对象可以是酶、底物、底物类似物、酶的活化剂或抑制剂等。总之，凡是可以影响酶催化反应的各种物质都有可能被分析。根据被分析对象是对反应速度的影响，还是对反应平衡的影响，其分析方法也有所不同。,32,例如，对酶活性的测定，只能采用与动力学相关的方法，而对底物的测定既可以采用动力学方法，也可以采用平衡法。常用的分析方法包括初速度法、固定时间分析法、固定变化分析法及平衡分析法等。有时还可以采用酶偶联分析法，使分析测定简单化。,33,5.2.1酶活性的测定为了检测酶催化反应就需要测定酶作用底物浓度的减小或产物的积累，所以要求底物或产物可以提供被检测的信号，并且要求底物与产物之间有比较大的信号差异，以便对一种的检测不受另一种的干扰。由于酶活性代表的是其催化反应的能力，所以、根据所催化反应的速度便可以得到酶的活性。无论是临床化学中酶的分析，还是在酶的分离、提纯过程，或者是对酶的性质的研究，都需要进行酶活性的检测。,34,测定单位时间内产物的增加量或底物的减少量的方法很多，常用的分析方法有分光光度法、滴定法、电化学分析法、荧光光度法、比旋光度法等。通常多选用测定产物的增加量，因为产物浓度由低向高变化，比较容易测定。,35,测定方法初速度法酶催化反应速度与酶和底物的浓度相关。酶促反应的初速度最大，且能保持恒定。但随着反应时间的增加反应速度会逐渐减小。所以，酶活性的准确信息必须通过测定反应的初速度来确定。反应初速度恒定的时间一般很有限，初速度的测定必须在此时间范围内进行。一般采取过量底物的方法来保证能够真实反映酶的活性。,36,固定时间分析法间隔一定的时间，分几次取出一定体积的反应液，使酶终止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。这是最经典的方法，至今仍很常用。但应注意，所选的时间段内酶活性不应有大的变化。,37,固定变化分析法这种方法与固定时间法的原理相同，把酶活性与要产生一定的反应量所需的时间关联起来，即酶的活性与产生一定的变化量所需的时间成反比。这种方法对于反应中产生pH变化的体系非常有用，因为这可以通过电位法方便地进行测定。,38,偶联法测定酶活性,有时需要将两个酶反应偶联起来以获得可被检测的信号。例如、葡萄糖在己糖激酶和ATP的存在下生成葡萄糖6磷酸及ADP，由于这样一个反应中没有明显的光谱性质的变化，所以无法对酶的活性进行直接的检测。,生成的葡萄糖6磷酸可以作为葡萄糖6磷酸脱氢酶的底物，并且在NADP存在下发生第二个酶反应，反应所生成的NADPH的紫外吸收在340nm，而NADP的最大吸收在280nm。据此可以对己糖激酶进行测定。,39,5.2.2底物的测定,酶循环法有些酶反应待测的底物的浓度非常低，采用一般的方法很难检测到产物的量。但可以采用酶循环法使偶联反应中的一种产物积累放大，当反应进行到一定的时间时，设法终止反应，并测定积累的产物，其量的大小直接与主反应中底物的量成正比。,40,待测,实测,例如：,41,底物的动力学测定法,根据米氏方程，底物在一定的浓度范围内是可以用动力学方法来测定的。但是，当底物的浓度很低时，反应速度很快就会变小，采用一般的方法很难测定反应的初速度。但采用一些特殊的偶联反应可以使得反应速度保持，从而可以获得精确的反应初速度的数据。这样一种设计的原理是通过循环过程使底物的浓度保持恒定因而指示反应的速度也保持恒定，该速度与第一个反应中底物的浓度成正比。,42,例：微量辅酶I(NAD)的分析。,在(1)式中，NAD在醇脱氢酶的存在下与乙醇反应生成乙醛和NADH，所生成的NADH又参与(2)式所示的反应，并使底物NAD复原，保证了底物NAD的浓度恒定不变，从而可以很方便地测定第一个反应的初速度，该速度与底物NAD的浓度成正比。,1,2,43,5.2.3酶的检测方法,分光光度法是利用底物与反应产物在紫外和可见光部分光吸收的不同，连续或固定时间测定反应一定时间内吸光度的变化。连续测定法适合于反应速度较快的体系，而固定时间测定法则适合于一些反应速度较慢的体系。许多氧化还原酶都可以根据反应过程中混合物吸光度的变化测定其活性。如脱氢酶以NAD+或NADP+作为辅酶，反应中形成NADH或NADPH，在340nm处可以观察到吸光度的变化。,分光光度法,44,只要酶反应的底物或产物之一有荧光或二者的荧光光谱不发生重叠就可以根据荧光的变化来测定酶的活性。如NADPH在340nm处吸收光后在460nm处会发出荧光。,荧光法,45,电化学法有多种电化学方法已经被用于酶活性的检测，其中应用最广泛的是电位计技术，它基于溶液的电势取决于被测物的浓度和性质、如pH电极可测定酶反应过程中反应液的pH的变化，从而得知参与反应的酶的活性。,46,极谱法是另一种常用的电化学方法。在溶液中浸入两个电极，其间加一个恒定的电位，通过检测反应过程中电流的变化来确定参与反应的酶的活力。基于这一原理的有氧电极法。有些酶促反应中，由于氧气的生成或消耗，引起溶液中溶解氧浓度的变化，从而引起电极之间电流大小的变化，由此可计算出酶的活力，,47,其他方法量气法量热法,48,5.3酶固定化技术和酶传感器,固定化酶定义为保留或分布在一定的微环境下并具有催化活性的生物催化剂。酶的固定化是指通过某种方式将酶与载体结合，使酶被集中或限制，从而使固定化酶易于从底物和产物中分离出来，这样可以使贵重的酶在流动系统或传感器上重复多次使用。,49,固定化酶有两种常用的方式：一种是先将酶固定到固相载体上，然后将其装在一个小柱子中成为一个固定化酶反应柱；另一种方法是将酶固定化在电极上以电化学的方式传导酶反内产物的信息。,50,酶固定化的意义固定化通常可以增加酶的活性和稳定性，并使酶的重复使用简单化。固定化酶的重复使用也降低了贵重酶的耗费。,51,对给定的酶，理想的固定化方法应该使酶具有高的转化数，同时随着使用时间的增加酶仍能保持高的话性。酶的固定化会对其物理化学性质产生影响，因此，固定化实验条件应小心选择。,52,5.3.1酶固定化方法,酶固定化方法没有固定的模式，一般都凭经验进行。主要有(1)吸附、(2)共价结合、(3)静电结合、(4)分子间交联、(5)凝胶包埋及(6)络合或金属结合。,53,固定化的目的是要提高单位载体所具有高的酶活力。因此，在固定化时，要充分考虑实验条件。尽量不改变酶的活性部位更不能导致酶蛋白变性。当固定化酶应用于食品时，就应该避免使用有毒的物质。,54,吸附,共价结合,静电结合,分子间交联,凝胶包埋,络合或金属结合,55,酶固定化中使用的载体可分为两大类，一类是无机载体，如高岭土、玻璃珠、氧化铝、胶态二氧化硅等等；另一类是有机载体，主要有纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、胶原蛋白等等。经常使用的固定相有明胶和可控硅玻璃型聚合物。,56,常见的酶固定化技术,57,5.3.2酶电极,酶电极(电化学传感器)属于生物传感器，一般定义为：将一个生化的和一个物理的转能器紧密地结合在一起，所产生的电信号与分析试剂浓度之间有一个计量的关系。生物化学转能器将分析对象转化为化学或物理的特性，然后由物理转能器将其转化为电信号。,58,酶电极是一种检测器，它由固定化酶和具有传感功能的电极紧密偶合在一起构成。酶能催化一种特定的反应并产生在电极上能响应的化合物。酶电极适合于测定各种气体(如氧气、氢气及二氧化碳等)、含氮化合物(如NO，NH3)、离子活性(如碱金属及重金属)及氧化还原性有机化合物，分析灵敏度在亚微摩尔数量级。,59,（1）采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。（2）专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。（3）分析速度快，可以在一分钟得到结果。（4）准确度高，一般相对误差可以达到1（5）操作系统比较简单，容易实现自动分析（6）成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱。（7）有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。在产控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。,生物传感器特点,60,生物传感器发展历史(R代表受体),61,酶法分析的优点分析化学上一个非常重要的问题是选择性问题，特别是当待测物的浓度非常低，而所存在的干扰物的浓度又很高时更是如此。酶反应的高选择性使得在极其复杂系统中低浓度物质的测定成为可能，因而避免了使用很复杂的仪器设备(如色谱和质谱)。而且当酶作为示踪试剂的抗体、结合蛋白等一起用于基于生物识别反应的分析时，其催化放大效应可以使分析方法的灵敏度得到大幅度的提高。,5.4酶法分析,62,5.4.1胞内酶活性的检测待测酶常存在于细胞内组织周围的液体、哺乳动物细胞生长的介质、细菌、酵母或菌类细胞中。在活性测定之前应注意下述两个因素：(1)在测定的早期应对蛋白水解酶的活性进行抑制。否则，它们会分解或破坏所要分析的酶的活性。(2)小分子的干扰，它们可能会错误地被当成是酶的底物或产物。特殊情况时它们可能就是酶的抑制剂。如果含血清的培养液用于哺乳动物细胞的培养，则应进行纯化或要进行血清酶活性的测定。,63,亚细胞样品酶活性的测定,64,5.4.2工业过程及产品中酶的测定,药物、去污剂工业，包括废物处理工业等都是酶应用的非常重要的领域。另外，酶在纺织、皮革、造纸及酒精工业等方面也具有很广阔的应用前景。,65,5.4.3临床诊断中酶的测定,生物体内的代谢活动都是由酶促反应支撑的，一个细胞中含有上千种酶并且在细胞各个组分中，酶的种类与含量不同。细胞内进行的复杂的生化反应在酶的催化作用下仍有序地进行着。生命活动的关键是依靠酶系统的完整性、酶活性的调节和酶含量