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流式细胞术,流式细胞术？,对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测,FlowCytometry,特点：速度快(10000cells/s)特异性强，灵敏度高(MRD:1/10000)多参数分析、活细胞分选,研究对象:单细胞悬液可检测的样本种类多样：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、藻类等,流式细胞术,FACSVerse,AccuriC6,LSRforttesa,现代流式细胞仪(Flowcytometer),FL2PE,SSC,FSC,电子系统,计算机系统,FL3PerCP,Cy5,FL1FITC,Lightdetectors,液流系统,光学系统,laser,流式细胞仪工作流程,流式细胞仪的构造,1.细胞样本成单列依次通过光检测区,液流系统,流动室（Flowcell）,Laser,Sample,流体动力学聚焦,鞘液：sheath,样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法鞘液压力恒定，流速不变通过调节样本压力调节样本进样速率,液流系统,液流驱动系统,调节样本进样速度,样本流与鞘液压力差改变，样本流直径改变，细胞间距改变,10psi,10psi,10psi,10.2psi,10.4psi,10.8psi,压力差样本流进样速度,Hi,Lo,Med,Lowpressure,Highpressure,细胞周期,FL3,0,1024,2048,3072,4096,Count,300,280,260,240,220,200,180,160,140,120,100,80,60,40,20,0,.,G0/G1CV=,2,.,42,G2/M,Sphase,G0/G1,GO/G1CV=,7,.,79,.,GO/G1CV=,7,.,79,流式细胞仪的构造,1.细胞样本成单列依次通过光检测区,2.激发并收集各种光信号,光学系统,激发光学系统:激发光源激光透镜和反射镜将激光引导到检测区域接收光学系统:滤光片等将产生的光信号引导到对应的光学接收器,激发光学系统:将激光引导到检测区域，产生光信号,激光,单波长高强度高稳定,488nmblue633nmred405nmviolet,LightSignals,光学棱镜,流式细胞仪检测信号,Laserbeam,1.散射光信号2.染色过细胞的荧光信号,前向角散射光(FSC),侧向角散射光(SSC),360度立体角,通过流式细胞仪我们可以得到-,相对细胞大小（前向角散射光-FSC）相对细胞颗粒密度和内部复杂度（侧向角散射光-SSC）染色过细胞的相对荧光强度（荧光-Fluoresentlight）,前向角散射光（FSC）,Forward(AngleLight)Scatter,FSC信号收集方向与激光束相平行FSC与被测细胞或颗粒相对大小及表面积相关,前向角散射光（FSC）,FSCisproportionaltorelativesize&cell-surfacearea,侧向角散射光（SSC）,Side-scatteredlight(90DegreeLightScatter),SSC信号收集方向与激光束相垂直（90）SSC与被测细胞或颗粒内部颗粒度和结构复杂度相关,侧向角散射光（SSC）,SSCisproportionaltocellgranularityorinternalcomplexity.,散射光（FSC&SSC）,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异通常使用“散点图”来看散射光信号散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,eg.MajorleucocytesubpopulationscanbedifferentiatedusingFSCandSSC.,Figure:CellsubpopulationsbasedonFSCvsSSC,DualParameterdot-plot,流式细胞仪检测信号,Laserbeam,1.散射光信号2.染色过细胞的荧光信号,自发荧光信号特异性荧光信号,荧光信号（Fluoresentlight）,双色荧光散点图,荧光强度（Fluoresenceintensity）,荧光信号的强度代表被测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质浓度。,荧光信号（Fluoresentlight）,荧光信号收集方向与激光束相垂直（90）,接收光学系统：接收光信号,并将光信号引导到对应的接收器中,光学滤片,LongpassShortpassBandpass,(500+/-25),FACSCalibur光路图,每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号,光学探测器,光电二极管-FSCPhotodiodes,光电倍增管-SSC&FluoresencePhotomultipliertubes(PMTs),光电转换器：将光信号转换为电信号,流式细胞仪的构造,3.光信号转换成电信号，数字化处理,1.细胞样本成单列依次通过光检测区,2.激发并收集各种光信号,电子系统,将光信号转化为电信号（模拟信号）将模拟信号转化为数字信号计算每个脉冲峰和计算机连接以传出数据,将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机,光信号转换为电信号,PMT电压电信号,电压脉冲的产生模拟信号,计算一个电压脉冲峰,面积是对荧光光通量进行积分测量的结果宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析）,模拟信号转换为数字信号,流式细胞仪的构造,3.光信号转换成电信号，数字化处理,4.数字信号传入计算机,1.细胞样本成单列依次通过光检测区,2.激发并收集各种光信号,数据的获取表现,专业软件中的数据表现,单参数直方图双参数散点图三维点图,等高图密度图,设门（Gating）,平均荧光强度,百分比,流式细胞仪的构造,1.细胞样本成单列依次通过光检测区,2.激发并收集各种光信号,3.光信号转换成电信号，数字化处理,4.数字信号传入计算机,5.活细胞分选,分选系统,检测,加电,偏转,收集,Review,Sorting,ReviewQuestions,在仪器设置中调高Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？,如何进行流式细胞实验？,1.样本处理2.荧光染料的选择3.染色4.数据收集和分析,1.样本处理,单细胞悬液,细胞悬液：直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小灌洗液、体腔积液培养细胞、细胞系实体组织：病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本,2.选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内根据抗原表达强弱选择荧光抗体荧光素光谱的重叠应当尽量减少,荧光信号（Fluoresentlight）,Fluorescein(FITC),400nm,500nm,600nm,700nm,Wavelength,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,Phycoerytherin(PE),Allophycocyanin(APC),633nm红激光,Excitation,Emisson,300nm400nm500nm600nm700nm,2.选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内根据抗原表达强弱选择荧光抗体荧光素光谱的重叠应当尽量减少,FACSCalibur光路图,每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号,2.选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内根据抗原表达强弱选择荧光抗体荧光素光谱的重叠应当尽量减少,2.选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内根据抗原表达强弱选择荧光抗体荧光素光谱的重叠应当尽量减少,荧光光谱重叠与补偿,530/30,585/42,利用电子术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”,荧光补偿,补偿前补偿后,2.选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内根据抗原表达强弱选择荧光抗体荧光素光谱的重叠应当尽量减少,3.染色,体积温度孵育时间对照,4.数据收集和分析,1)画图（直方图，散点图）2)调整仪器设置到合适的状态3)寻找目标细胞4)我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？,仪器设置调节,1.用阴性细胞调整仪器PMT电压,2.用单染色的细胞调节仪器补偿,二原则：,同型对照（Isotypecontrol）,例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITCP