细菌与病毒的微生物学检查法

.,.,第七章细菌与病毒的微生物学检查法,微生物学教研室Jiz-Zhaoj12zhao,.,教学大纲,掌握内容标本的采集和送检原则病原菌的检验程序细菌感染的血清学诊断及常用方法了解内容病原体的抗原成分、核酸及其他成分的检测方法,.,病原学检查的目的,进行病因学诊断指导合理用药观察治疗进行传染病的流行病学调查,标本的采集和送检六原则,无菌操作：避免杂菌污染,不同期不同标本,用抗生素以前,采集病变明显部位,运送注意保存,采集双份血清,.,第一节细菌感染的微生物学检查法,.,可疑细菌感染,采集标本,血清学实验双份血清,直接形态学检查,细菌成分检测,特异性抗体检测,细菌分离培养,鉴定,形态学检查生化学检查血清学鉴定药物敏感实验动物（毒力）实验,抗原检测,核酸检测,直接凝集实验协同凝集实验乳胶凝集实验免疫荧光检测ELISA等,核酸杂交聚合酶链反应（PCR）DNA芯片,凝集反应沉淀反应补体结合试验中和试验ELISA等,.,细菌学诊断,检测病原菌成分,检测患者血清中特异性抗体,细菌病原学检查法,形态学检查分离培养,纯培养生化试验血清学鉴定药物敏感试验毒力实验动物实验,抗原,核酸,.,一、细菌学诊断,.,（一）形态学检查,光学显微镜检查法：细菌染色检查法革兰染色法抗酸染色法负染法暗视野检查：用于检查活菌、螺旋体及其动力荧光显微镜,.,脑脊液的直接涂片染色-肺炎链球菌,.,链球菌,.,淋病奈瑟球菌-脓液直接涂片,.,结核分枝杆菌,.,霍乱弧菌,暗视野显微镜,钩端螺旋体,肺炎双球菌,.,病原菌的分离培养/直接涂片,大小形态颜色表面性状透明度溶血性,Flamesterilizewireloop,metalforceps,etcbeforeandafteruseinahoodedBunsenburner,.,细菌动力的检测,.,化脓性球菌,葡萄球菌,链球菌,.,肠道杆菌,大肠埃希菌,沙门氏菌,志贺菌,细菌形态无特异性可采用生化学检查法-鉴别细菌的重要方法,（二）生化试验,糖发酵试验H2S试验枸橼盐利用试验,鉴定中最重要的生化反应,乳糖发酵试验,肠道非致病菌（埃希菌属）发酵乳糖、产酸产气,肠道致病菌（志贺菌属、沙门菌属等）不发酵乳糖,.,（三）血清学鉴定,利用含已知的特异性抗体的免疫血清，检测未知的细菌抗原，对细菌进行种的鉴定志贺菌属、沙门菌属常用方法是玻片凝集试验,.,测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力方法：扩散法、稀释法,（四）药物敏感试验,MIC&MBC,最低抑菌浓度，MIC最低杀菌浓度，MBC,.,全自动分析仪,全自动细菌鉴定仪,全自动生化分析仪,.,（五）检测毒力-动物实验,1.常用动物MouseGuineaPigRabbitDogMonkey,.,接种途径,皮内皮下腹膜内静脉颅内椎管内鼻内灌胃,.,毒力检测,半数致死量LD50半数感染量ID50,.,二、检测病原菌成分,抗原的检测核酸的检测,.,（一）抗原的检测,利用已知的特异性Ab检测Ag的方法常用的方法有玻片凝集协同凝集试验ELISA免疫荧光法,.,ELISA,.,（二）核酸检测方法,聚合酶链反应（PCR）核酸杂交技术SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization基因芯片(Genechip)16SrRNA,.,16sRNA基因序列分析,只存在于原核细胞型微生物的染色体基因中16sRNA，23sRNA,5sRNA可变区和保守区保守区：所有的细菌所共有可变区：属和种的特异性,PCR,GeneChip,.,.,三、抗体的检测,用已知细菌或其Ag检测相应的特异性Ab及其量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断急性期和恢复期双份血清，恢复期效价升高4倍有诊断价值方法玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、冷凝集试验、ELISA局限难以早期诊断,.,第二节病毒感染的微生物学检查法,形态学病毒的分离鉴定在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒成分的检测病毒抗体的检测,.,.,（一）病毒的形态学检查,电子显微镜（EM）免疫电镜,IEM光学显微镜（CM）包涵体内基小体（Negribody）,HAV,Negribody,动物接种：动物模型,鸡胚接种：914d,组织培养,器官培养,组织培养,细胞培养,原代细胞培养,二倍体细胞培养,传代细胞培养,三大培养方法,（二）病毒的分离培养的方法,.,血凝抑制实验中和实验PCR检测,病毒分离培养及鉴,.,细胞病变（cytopathy)红细胞吸附(hemadsorption)病毒干扰作用(viralinterference)中和试验(neutralizationtest,NT)空斑形成试验(plaqueformation),病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标,细胞病变细胞病变效应（CPE）,细胞病变红细胞吸附：血凝素（HA）病毒干扰作用中和试验病毒数量及感染性的检测空斑形成试验红细胞凝集,红细胞吸附,病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标,plaque,空斑形成试验,用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用一个空斑是由一个病毒大量复制而成，称为空斑形成单位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示,（三）病毒成分的检测,病毒抗原的检测:ELISA病毒核酸的检测核酸杂交、PCR、基因芯片,.,病毒成分的检测,.,（四）病毒抗体的检测,中和试验（NT）血凝抑制试验（HT）补体结合试验（CF）ELISA法蛋白印迹技术,.,小结,细菌感染的微生物学检查法病原体检查核酸的检测抗原、抗体的检测病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜病毒的分离培养和鉴定核酸的检测抗原、抗体的检测,.,小结,抗细菌免疫固有免疫获得性免疫抗病毒免疫固有免疫干扰素获得性免疫,.,问题,采集标本的原则？病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标？干扰素的概念及其抗病毒机制,.,自检内容,1.机体抗结核分枝杆菌的感染免疫主要依赖A.屏障结构B.细胞免疫C.抗体的中和作用D.非特异性免疫分子E.吞噬细胞的吞噬作用2.灭活和清除游离病毒主要依靠A.干扰素B.抗体C