环境污染物的一般毒性及其评价方法

第五章环境污染物的一般毒性及其评价,主讲教师：刘薇大连理工大学环境学院,生态毒理学(Ecotoxicology),一般毒性和特殊毒性,一般毒性,特殊毒性,急性毒性亚慢性毒性和慢性毒性蓄积毒性局部毒性,致癌性致突变作用生殖和发育毒性,5.1毒性评价的实验基础,流行病学资料和临床观察，可以获得环境污染物对人类健康的危害。毒理学实验为阐明毒性特点、毒作用机制、剂量-反应关系，预测对人类健康的潜在危害一般规律，为制订卫生标准提供科学依据。,一般毒性实验,急性毒性实验亚慢性和慢性毒性实验蓄积实验,毒理学试验目的,1.阐明受试物毒性表现和性质2.阐明毒性作用的剂量-反应(效应)3.确定毒作用的靶器官4.阐明毒性机制5.确定损害的可逆性,5.1毒性评价的实验基础,一.实验动物的选择,1.实验动物(laboratoryanimal),经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。,Wistar大鼠,豚鼠,5.1毒性评价的实验基础,2.选择实验动物的基本原则,1.毒性反应及代谢特点与人类相近2.自然寿命适宜3.易于饲养和实验操作4.经济并易于获得5.对受试物敏感,一.实验动物的选择,3.毒理学实验常用动物主要品系(strain）,(1)近交系动物,采用连续20代以上兄妹间交配或亲子交配而培育的纯品系动物。津白、津白165，BALB/C，C3HC57B/6J小鼠等。,BALB/cA,津白,一.实验动物的选择,(2)突变系动物,动物在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的办法，使其某个基因发生突变，并丧失了原有的正常功能。这种突变的基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品系动物。,无胸腺裸鼠,一.实验动物的选择,两个不同近交系之间有目的进行交配，所产生的杂交第一代动物。,(3)杂交群动物,5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群。昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等。,(4)封闭群动物,一.实验动物的选择,4.微生物控制级别,(1)无菌动物体内外均无任何微生物和寄生虫的动物。(2)无特定病原体动物（SPF）体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物。容许携带非特定微生物，但不能携带传染性病原菌。(3)清洁动物最低限度疾病动物。动物体内外不携带人畜共患的病原体或动物传染病病原体。抗体检查常发现脑脊髓质炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体。但不应有临床症状、病理改变及自然死亡。饲养在半屏蔽系统。,一.实验动物的选择,1.年龄2.性别3.生理状态4.健康状况,5.个体选择要求,一.实验动物的选择,可根据人类实际接触方式和受试物的理化性质等因素，选择合适的染毒方式。,1.经口染毒灌胃，喂饲，胶囊2.经呼吸道染毒静式吸入染毒，动式吸入染毒3.经皮染毒4.皮下、静脉注射和腹腔内注射5.其他,二.常用染毒方式,三.毒理学试验中的常用对照组,1.未处理对照组(空白对照组)本底值，质量控制2.阴性(溶剂赋形剂)对照与染毒组比较的基础3.阳性对照检测试验体系的有效性和准确性4.历史性对照检查试验体系的稳定性，即进行实验室质量控制和保证,四.受试样品要求,用同一种、同一批号受试物受试物成分和配方必须固定如存在异构体混合物，则要求异构体比例必须固定活性成分的含量和杂质的浓度应固定受试物保质期内不发生分解，掺入到饲料惑溶液中也要求稳定,五.实验结果的判断,1.实验组与对照组比较有无显著性差异2.剂量-反应关系和剂量-效应关系3.其他相关参数的改变4.是否在“正常”值范围,一.急性毒性,急性毒性(acutetoxicity)指机体一次接触或在24小时内多次接触化学物后，短期内引起的毒效应。,死亡行为生理生化指标的异常变化病理学改变,5.1急性毒性及其评价,急性毒性实验目的,1.致死剂量、急性阈剂量、初步估计对人类毒害的危险性。2.阐明急性毒性强度、特征、可能的靶器官、致死原因和剂量反应(效应)关系。3.体内生物转运和转化，及其动力学变化。4.为设定蓄积性、亚慢性、慢性毒性实验的染毒剂量、观察指标提供参考依据。,一.急性毒性,急性毒性参数,1.绝对致死剂量或浓度(LDl00/LC100)2.最小致死剂量或浓度(MLD/MLC)3.最大耐受剂量或浓度(MTD、LD0/MTC、LC0)4.半数致死剂量或浓度(LD50/LC50)5.急性毒性LOAEL6.急性毒性NOAEL7.急性毒作用带(Zac),一.急性毒性,二.急性毒性实验的动物选择,健康成年动物未曾交配或受孕大鼠(180240g)小鼠(1825g)家兔(22.5kg)猫(1.52.0kg),气态毒物的粘膜刺激猫皮肤的局部刺激作用豚鼠，家兔过敏反应豚鼠、家兔、狗、小鼠、猫呕吐反应狗、猫,哺乳动物,三.急性毒性实验染毒方式,1.经口(胃肠道)接触(1)一次灌胃体积小鼠0.10.5ml/10g体重大鼠0.51.0ml/100g体重(2)吞咽胶囊家兔及猫、狗等大动物,实验动物染毒前应禁食，染毒后也应继续禁食34小时。,2.经呼吸道接触,常温、常压下为气态，或以蒸气态、气溶胶、烟、尘状态污染生产环境与生活环境空气。静式染毒动式染毒,3.经皮肤接触,应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象。家兔和豚鼠为首选，也可用大鼠代替。,三.急性毒性实验染毒方式,四.半数致死量测定程序,1实验动物性成熟、健康，雌雄各半2化学结构、理化性质和毒性参考资料3预试验求出全活、全死剂量4正式实验在求出全活、全死剂量之间设56个实验组组距1.21.5倍小鼠、大鼠10只/组、家兔46只/组如化合物毒性有性别差异，则应分别计算雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。,观察持续时间和饲养条件,观察期一般为14天内的总死亡数。速死性毒物求其LD50(LC50)，应计算24小时的死亡率。LD50值的表示应注明染毒途径和观察时间，以便于在进行毒性比较时有可比性。在观察期间，应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。,四.半数致死量测定程序,中毒症状观察,应详细地观察记录动物的中毒症状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点、死亡时间等。很多毒物初期往往初期先出现兴奋或抑制现象。应注意体重变化。粘膜刺激症状，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改变等。,四.半数致死量测定程序,病理学检查和其它指标观察,在观察期间中毒死亡动物应及时解剖，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查。对存活动物在观察期结束时，应做全部动物解剖，逐一进行病理学检查。,四.半数致死量测定程序,计算LD50和LD5095%可信限,1.霍恩式法2.简化寇式法3.直接回归法,四.半数致死量测定程序,五.急性毒性分级,单位：mg/kg,根据大鼠一次经口LD50的急性毒性分级,急性毒性阈剂量(浓度),一次染毒引起某种毒性反应的最小剂量，属于非致死性指标。,未知毒性污染物：可选择综合性、非特异性指标。如体重，活动能力，应激状态、条件反射等。已知毒性比较了解的可选择最敏感的指标刺激性气体或蒸汽：可选择眼睛和嗅觉刺激阈浓度。,观察指标的选择,急性毒性试验的局限性,1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,急性毒性阈剂量实验方法,游泳实验反映体力和活动能力,刺激阈实验反映对上呼吸道、眼睛和口腔等粘膜的刺激作用,猫置于染毒柜内，加入受试物，观察症状30min症状：流泪、流缔、喷嚏、呛咳、流涎等50%实验动物出现症状的最小浓度刺激阈浓度,水槽水温20动物放入水中，记录从放入到沉没5秒所需要的时间记录游泳速度和游泳姿势,一.慢性毒性和亚慢性毒性,在日常生活环境中，人类接触环境污染物的浓度远低于急性致死浓度，但接触的时间则较长。为了评价在较长的一段时间内反复接触低浓度环境污染物的毒性作用，获得接近于人类实际接触条件下的毒性资料，需进行亚慢性或慢性毒性试验。,5.2环境污染物的亚慢性、慢性毒性及其评价,亚慢性毒性(subchronictoxicity)在一段时间内（13个月）连续摄入、较大剂量环境污染物引起的毒性效应。,慢性毒性(chronictoxicity)长期连续、低剂量摄入环境污染物（6个月终生）引起的毒性效应。,5.2环境污染物的亚慢性、慢性毒性及其评价,二.亚慢性毒性及评价方法,1.在急性毒性试验的基础上，在较短时间内了解受试物对机体长期作用时的主要毒性性质和特点、靶器官和最大耐受剂量2.探讨敏感指标及其剂量-反应（效应）关系3.为慢性毒性试验设计提供依据。,亚慢性毒性评价目的,实验动物和分组大鼠或小鼠健康，幼龄每组1020只雌雄各半,染毒途径,染毒剂量和实验期限,1.1/201/5LD50范围内设三个剂量组，设对照组2.无蓄积作用，排泄快的毒物还可适当加大剂量3.低剂量组动物不会产生可观察到的毒性反应4.高剂量组动物出现明显的中毒反应，但不引起动物死亡（或10%）5.13个月,与人类实际接触的方式和途径相同,亚慢性毒性试验,二.亚慢性毒性及评价方法,亚慢性毒性实验观察指标,1一般性指标体重、食物利用率、活动能力等指标2特异指标特异性反应,能更确切地阐明受试物引起的有害影响的阈剂量及最大无作用剂量。应尽量选用特异指标。3血液学及生化学指标血常规，骨髓细胞成分、血清和尿液生化学检查4有害物质在体内的分布、代谢及排泄指标5病理组织学检查死亡的动物应作病理检查。实验结束时，全部动物进行剖检，测定脏器系数，应特别注意靶器官的变化。肝、肾等组织应列为常规检查项目。,二.亚慢性毒性及评价方法,试验结果评价,1确定毒性作用阐明亚慢性毒性的性质、特点、毒效应类型、作用强度和靶器官。2确定毒性作用的敏感指标3中毒阈剂量和最大无作用剂量,二.亚慢性毒性及评价方法,慢性毒性实验的目的,本实验目的是评价环境污染物在长期、小剂量、反复作用条件下，对机体产生的损害及其特点，确定其慢性毒性阈剂量和最大无作用剂量，为制订环境中有害物质的最高容许浓度(MAC)和人类每日容许摄入量(ADI)提供科学依据。,三.慢性毒性及评价方法,慢性毒性试验设计,初断乳的大鼠或小鼠。每组2040只，雌雄各半。设34个实验组和一个对照组。,实验动物和分组,染毒剂量和实验期限,对照组溶剂对照低剂量组1/100亚慢性毒性阈剂量不出现中毒反应无作用剂量组NOAEL中剂量组1/10可出现轻微的毒效应LOAEL高剂量组1/5出现明显的毒效应甚至亚致死状态实验期间6终生实验结束后可停止染毒观察恢复状况,染毒方式和观察指标选择原则同亚慢性试验，尽量选择在亚慢性试验中观察到的特异和敏感指标。,三.慢性毒性及评价方法,慢性毒性实验注意事项,1控制实验条件排除干扰因素对实验结果的影响2试验前应对观察指标，尤其是血、尿常规及重点测定的生化指标进行正常值测定，筛除个体差异过大的动物3染毒期间进行动态观察的各项指标，应与对照组同步测定4各化验测定方法应精确、可靠、需要进行质量控制。5应重视病理组织学的检查。凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织学检查。,三.慢性毒性及评价方法,慢性毒性实验结果评价,1观察指标与对照组比较，是否超出正常值范围，是否具有显著性差异和剂量-效应(反应)关系2根据实验期间和恢复期的观察和检测结果，进行全面的综合分析。结合受试物的理化性质和结构特性，应用生物学和医学理论，阐明慢性毒性的性质、特点、毒作用类型、靶器官和中毒机理。3确定敏感指标的慢性毒性阈剂量(LOAEL)和最大无作用剂量(NOAEL)。,三.慢性毒性及评价方法,5.3蓄积毒性,连续多次摄入的环境毒物总量（或速度），大于代谢和排泄速度时，毒物或其代谢产物在体内逐渐增加并贮留现象叫做毒物的蓄积作用(Accumulation)。,蓄积毒性评价方法,固定剂量法,1.先测定一次经口LD502.每日固定剂量(1/201/5LD50）选定一个剂量，固定时间和相同途经连续染毒，至一半实验动物死亡。3.如果累积剂量达到5个LD50，即使未引起一半动物死亡，也可以终止试验。,剂量递增法,固定剂量的20天蓄积实验,阴性对照实验组：1/20LD50,1/10LD50,1/5LD50,1/2LD50,结果判定：,1.各实验组均无死亡，无蓄积性2.1/20LD50组，有死亡，其他组无死亡，弱蓄积性3.除1/20LD50组之外，其他组均有死亡，中等蓄积性4.各组均有死亡，且呈剂量反应关系，强蓄积性,连续染毒20天,5.4局部毒性测定实验,急性皮肤刺激/腐蚀试验,豚鼠或家兔皮肤染毒424h洗去残留毒物，观察染毒后24、48、72小时涂抹部位的皮肤反应,急性眼睛刺激/腐蚀试验,家兔0.1ml受试物滴入眼结膜囊内，记录染毒后1、12、24、48、72、96h的局部反应。检查结膜充血和损伤、角膜透明度、虹膜纹理和角膜损伤,毒理学研究方法的优缺点比较,流行病学研究受控的临床研究体内试验体外试验,真实的暴露条件规定的限定暴露条件易于控制暴露条件影响因素少，易于控制化学物之间在人群中测定反应测定多种效应可进行某些深入的研的联合毒性作用对某组人群(如哮喘)评价宿主特征的作用究(如机制