分子生物学完整第16讲ppt课件

.,1,三、阻遏蛋白与操作子的相互作用（一）操作子上与阻遏蛋白结合的位点1，lacI基因的表达特点2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合（1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据,.,2,（2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5+21(26bp)B，阻遏蛋白保护位点C，lacO的结构及其与阻遏蛋白的结合性质,.,3,.,4,3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响（1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合（2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109）,.,5,（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始（4）阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意4，上述模式不一定适用于其他系,.,6,（二）阻遏蛋白上与操作子结合的位点1，阻遏蛋白单体的结构（1）长头片段（longheadpiece）（2）短头片段（3）核心片段（core）（4）铰链区,.,7,2，阻遏蛋白四聚体的结构3，阻遏蛋白与操作子的结合4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用（1）lac系统存在多个操作子（2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合（3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平,.,8,（三）阻遏蛋白与操作子的解离1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据2，诱导物与阻遏蛋白的结合3，阻遏蛋白与不同DNA的结合（1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性（2）细胞内阻遏蛋白的结合位点（3）细胞内阻遏蛋白的存在,.,9,（四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体1，i-突变体2，iS突变体3，it突变体4，i-d突变体等位基因互补5，Oc突变体,.,10,第四节分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控,一、分解代谢产物抑制1，某些启动子转录的起始需要辅助蛋白质某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶识别位点（-35序列/Sextama框）和结合位点（-10序列/Pribnow框），需要辅助蛋白质参与转录的起始,.,11,最常见的是大肠杆菌对碳源利用有关的一组操纵元，受一种代谢产物激活蛋白（cataboliteactivatorprotein，CAP）控制，在葡萄糖存在时保证细菌优先利用葡萄糖,.,12,2，分解代谢产物抑制含义：葡萄糖会引起许多操纵元（包括乳糖操纵元、半乳糖操纵元和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏原因：葡萄糖引起cAMP含量下降，使分解代谢产物激活蛋白失活，从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳源的代谢相关酶的表达,.,13,二、CAP对启动子的正调控1，cAMP在分解代谢产物抑制中的作用葡萄糖引起cAMP水平下降是分解代谢产物抑制的原因cAMP由腺苷酸环化酶（adenylatecyclase，cya）合成cya基因突变体对葡萄糖变化没有反应,.,14,2，CAP的作用（1）CAP的结构特征CAP是同源二聚体，由两个22.5KD的亚基构成CAP单体含DNA结合区及转录激活区,.,15,（2）CAP结合的DNA位点CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序列阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸序列中（TGTGA），该序列可能是识别的必需成分,.,16,CAP与有两个（相反的）五核苷酸序列的位点结合最强，因为这样两个单体均可结合DNA,.,17,相对于RNA聚合酶的结合位点，CAP可以与不同的DNA位点结合,.,18,（3）CAP的激活只有当cAMP存在时，CAP才具有活性,.,19,（4）CAP对转录的激活作用A，CAP激活转录的途径直接与RNA聚合酶作用作用于DNA，以某种方式改变其结构以利于RNA聚合酶的结合,.,20,B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用CAP二聚体结构保证了一个亚基可与RNA聚合酶接触，哪一个亚基以何种方向与DNA结合无关紧要,.,21,C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置：CAP位于启动子内部（如gal）时，可提高闭合复合物向开放复合物的转化速率当CAP位于启动子临近位置（如lac）时，其主要作用是提高最初结合的速率，以形成开放复合物,.,22,第四节操纵元的其他调控形式,一、具有双启动子的半乳糖操纵元（一）半乳糖代谢1，半乳糖代谢相关的酶（1）半乳糖激酶（2）半乳糖转移酶（3）半乳糖表异构酶,.,23,2，代谢步骤（1）半乳糖+ATP半乳糖1-磷酸+ADP+H（2）半乳糖1-磷酸+UDPGluUDPGal+葡萄糖1-磷酸（3）UDPGalUDPGlu总反应：半乳糖+ATP葡萄糖1-磷酸+ADP+H,.,24,（二）gal操纵元1，gal操纵元组成（1）结构基因（galK，galT，galE）（2）调节基因（galR）与结构基因相距很远诱导物：半乳糖galR突变：造成组成型表达（3）P/O位点galOC突变：造成组成型表达,.,25,2，gal操纵元的启动子（图89）（1）galP1转录起始位置：S1（+1）转录依赖cAMP-CAP功能：葡萄糖不存在时负责gal操纵元的转录（2）galP2转录起始位置：S2（-5）转录不依赖cAMP-CAP功能：葡萄糖存在时负责gal操纵元的转录,.,26,（三）cAMP-CAP对galP1和galP2的控制1，gal启动子的cAMP-CAP结合位点（1）位置：-76-47（2）序列特点（图810）具有保守性和对称性,.,27,2，cAMP-CAP对S1转录的激活及对S2转录的阻遏对galP1：有激活作用对galP2：cAMP-CAP结合位点离galP2较近，妨碍RNA聚合酶与galP2的结合,.,28,（四）Gal阻遏蛋白的作用机制1，gal阻遏蛋白的作用位点galOE：位于-60左右galOI：与galOE相距90bp,.,29,2，gal阻遏蛋白可能的作用机制（1）gal阻遏蛋白与galOE结合，可能通过以下途径发挥作用：妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合或改变cAMP-CAP对转录的促进作用,.,30,（）gal阻遏蛋白与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构，两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应,.,31,（五）gal操纵元双启动子的意义1，半乳糖的双重作用（1）作为细菌的碳源（2）UDPGal是细菌细胞壁的重要前体2，双启动子的作用（1）galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源（2）galP2保证有葡萄糖存在时，细菌可以合成UDPGal,.,32,二、阿拉伯糖操纵元：具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白(一)阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元1，阿拉伯糖调控元,.,33,（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元araBADaraE，araFG：E，F，G编码膜结合蛋白，与阿拉伯糖的结合与转运有关调节基因：araC（2）调控元：由一个调节基因控制几个操纵元的系统,.,34,2，araBAD操纵元的组成（1）结构基因araB：编码L-核酮糖激酶araA：编码L-阿拉伯糖异构酶araD：编码L-核酮糖-5-磷酸-表异构酶,.,35,（2）操纵元结构（图8-11）araC及araBAD各有启动子，但转录方向相反,.,36,（二）araBAD操纵元的调控,.,37,1，araC基因产物及其结合位点（1）araC基因对araBAD正调控的遗传学证据（2）AraC蛋白的2种形式Crep：未结合阿拉伯糖的AraC蛋白Cind：结合阿拉伯糖的AraC蛋白,.,38,（3）AraC结合位点araO1(-110-140)：与araPC重叠araO2(-265-294)araI(-40-78)：下游与RNA聚合酶结合位点紧密相连，上游与CAMP-CAP结合位点（-107-78）紧密相连,.,39,2，对araBAD操纵元起调控作用的因素（1）Crep对araBAD及araC的作用A，Crep与araO1结合有效阻遏araC基因的转录对araBAD有轻微的阻遏,.,40,B，Crep与araO2结合与araO2结合的Crep通过与结合在启动子上的其他蛋白质发生相互作用，实现对araBAD的有效阻遏。两种蛋白质之间的DNA形成环状结构，其间插入非螺旋整倍数目的核苷酸将改变两种蛋白质在DNA双螺旋侧面上的位置关系，从而降低阻遏效率Crep二聚体同时结合araO2和araI，实现对araBAD的有效阻遏,.,41,（2）Cind对araBAD及araC的作用Cind与araI结合激活araBAD基因的转录Cind与araO1结合阻遏araC基因的转录（3）cAMP-CAP是araBAD和araC表达的正调控因子,.,42,3，araBAD操纵元的调控（图812）（1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录，但很快会被Crep所阻遏（自身调控）（2）有AraC，无cAMP-CAP时，araBAD和araC均不转录（3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时，araBAD转录（4）Cind和cAMP-CAP促进araBAD转录的机制促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成开放性启动子复合物,.,43,三、色氨酸操纵元：可阻遏系统（一）trp操纵元的结构1，结构基因及其编码的酶trpE，trpD：编码邻氨基苯甲酸合成酶的2个亚基，各为60KDtrpC：编码吲哚甘油磷酸合成酶，分子量为45KDtrpB，trpA：编码色氨酸合成酶的亚基（50KD）和亚基（29KD）,.,44,2，前导序列trpO与trpE之间有一段162bp的序列可以转录到mRNA中3，终止子在trpA基因下游36bp处有一个不依赖于因子的终止子t在t的下游250bp处有一个依赖于因子的终止子t4，调节基因调节基因trpR与Trp操纵元相距较远，编码阻遏蛋白,.,45,（二）Trp操纵元的阻遏调控1，Trp的作用Trp有两方面的作用（1）对