层析工艺设计以及优化.ppt

层析工艺设计和优化,李岩email:liyan中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,第一部分基础理论,分离纯化的一般流程,破碎细胞概述,珠磨,压榨,固体剪切,高压匀浆,超声,液体剪切,机械法,冻溶法,酶溶,化学,去垢剂,溶胞作用,非机械法,细胞破碎方法,压撞剪切渗透冻胀破壁破膜,超声破碎(Ultrasonication),作用机理：声频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理一般认为与空化现象(Cavitation)引起的冲击波和剪切力有关。空化现象是在强声波作用下，气泡形成、长大和破碎的现象。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。,反复冻融法,细胞含有大量水份，快速冷冻时，胞内水结晶形成大量晶核，体积增大将细胞胀破达到破碎细胞的目的；此外，冷冻过程促使细胞膜疏水键断裂增加了细胞的亲水性。一般将40-70%的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻，冻结后，取出在室温下融化，然后再冷冻，反复进行，通常需三次以上，酶的释放率才可能达到满意。冻融法十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。,高压匀浆法,高压匀浆器：由高压泵和匀浆器组成易于实现工业放大,珠磨破碎法,利用珠磨机内大量的研磨剂(玻璃珠、钢珠或陶瓷珠)在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的目的。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留珠体，从而实现连续操作。,高压匀浆法同高速珠磨法的比较,不论高压匀浆法和高速珠磨法，都不仅以破碎率为基准，而需考虑产物的收率和兼顾上下游过程,澄清技术概述,离心：适用于实验室过滤：板框过滤适用于生产微滤：采用不同的组件适用于实验室和生产规模,分离方法概述,沉淀法：经典的方法（血液制品生产中仍在沿用）超速离心：分离病毒的经典方法超滤：主要用于浓缩和缓冲液置换层析：目前GMP发展的趋势,沉淀法,盐沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀酸沉淀非离子多聚物沉淀聚电解质沉淀,水化层的破坏静电排斥力的降低疏水性的增加大分子的介导,脱水过程示意图,冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白,各步所沉淀下来的蛋白,超离心技术,发展历史Svedberg，winnerofthe1926NobelPrizeinchemistryforhisworkoncolloidsandhisinventionoftheultracentrifuge优良的学术传承Tiselius1948年诺贝尔化学奖BjornIngelman发现了葡聚糖PorathandFlodin于1959年在Nature上发表了有关凝胶过滤层析的第一篇论文,书籍推荐,金绿松，林元喜主编离心分离，化学工业出版社出版，2008年,单元操作超速离心,因子Fr：离心力/重力的比值离心分离Fr=1.11910-5n2rn:转速，转/分钟；r:转鼓半径，cm衡量离心设备的离心程度的重要技术参数,按分离因子Fr分类1)、常速离心机Fr3,000g2)、中速离心机，Fr=3,0005,000g3)、高速离心机，Fr=5,00020,000g4)、超速离心机，Fr=20,0001,000,000g,超速离心法在疫苗纯化中的应用,对于非球形颗粒,浮力密度,大分子在不同梯度介质中的浮力密度不同，和大分子在介质中的水化程度有关，在高离子强度介质中的浮力密度增加，在低离子强度介质中浮力密度降低。,沉淀系数的物理意义,沉淀系数指单位离心力场（w2x）作用下的沉降速度（dx/dt），沉降系数的单位为秒蛋白质、脂蛋白、核糖体和病毒等的沉降系数介于1*10-13200*10-13秒。为方便起见把10-13秒作为1个单位，成为Svedberg单位,区带离心和区带转子,区带离心是指把样品中不同的颗粒分离成不连续的区带区带转子是指一类结构与操作方式特殊的转子,密度梯度离心,速度-区带密度梯度离心法将样品置于一密度梯度介质顶层，该梯度最大密度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各物质按其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分离的方法。等密度梯度离心法等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的唯一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可用此法分离。,转子类型,角转子,甩平转子,垂直转子,规模化生产的超速离心机,OptimaL-100XP100,000rpm;802,400 xgOptimaL-100K100,000rpm;802,400 xgOptimaL-90K90,000rpm;694,000 xgOptimaL-80XP80,000rpm;602,000 xg,密度梯度离心病毒颗粒的制备,密度梯度的加样量,样品浓度过大，会产生液流，并且有可能产生沉淀。过高的浓度也会使分离区带变宽而丧失分辨率。当颗粒沉降系数或者浮力密度差较小时，上样体积不超过梯度体积的5%。梯度斜度越大，承载的样品量也越大。比如10-50%梯度的最大上样量要比5-20%梯度的最大上样量大。对于区带转子，样品浓度低于起始梯度浓度的40%。,蔗糖密度梯度离心,离心时间的影响（改变颗粒移动的时间）密度梯度的影响（改变介质的密度，从而改变颗粒的移动速度）离心温度（改变离心介质的粘度，从而改变颗粒移动速度）,仅通过蔗糖密度梯度离心很难得到EV71病毒颗粒的纯品，在此体系中条件优化不能实现质的提高,CsCl等密度梯度离心的条件摸索,等密度离心介质的筛选,234M567,注：KBr在4C下结晶析出，所以没有考察,采用NaBr代替昂贵的重金属盐CsCl，为EV71的纯化提供了一个新的途径！,单元操作超滤,膜分离特点,膜分离技术是用半透膜作为分离层，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能源等优点。膜分离的驱动力是膜两侧溶液状态的差别。膜两侧的压力（微滤、超滤、反渗透）、浓度（透析、渗透蒸发）、电位（电渗析）等的差别均可作为分离的驱动力。,微滤和超滤,微滤的分离原理为筛分原理，膜的孔径为0.0510m，采用的压力为0.050.5MPa。微滤技术主要用于消毒、澄清、细胞收集等过程。超滤的分离主要也是筛分原理，但有些情况下受到粒子荷电性的影响。超滤膜的孔径为0.0010.05m，它可以分离分子量从3k到1000kDa的可溶性大分子物质，采用的压力为0.11MPa。超滤技术主要用于浓缩，也可以用于分离过程，但是分离效率不高。当目标蛋白质与杂质的分子量差别达到一个数量级时，才可能用超滤技术实现有效的分离。,影响分离的因素,膜的类：包括膜的材料，膜孔的大小，膜的内部结构以及膜组件的类型等。操作条件：包括膜两侧压差、切向流速和温度等。溶液环境：包括蛋白质浓度、物料的pH值、盐的类型及其浓度等。,浓度极化,A:过滤，被膜阻挡物质在膜表面积累，形成浓度梯度B:切向流动使膜表面积累的物质在剪切作用下返回液流当A速度B速度时：在膜面附近形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓度极化可逆过程，在过滤中产生，停止过滤，极化逐渐消失,A,B,曲线代表被膜阻挡物质的浓度变化，在距离膜表面处形成边界层，浓度呈指数形式增加,膜的污染,与初始纯水透水率相比，可降10%到80%,层析的分类,吸附解吸类蛋白质分子与介质有相互作用离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析非吸附解吸类蛋白质分子与介质之间没有相互作用体积排阻层析：根据分子大小进行分类,吸附解吸类层析,配基的类型决定色谱的模式,Affinity(Biorecognition)生物识别,Ionexchange(Charge)电荷,层析的影响因素,溶液pH溶液温度溶液盐浓度溶质浓度,介质粒径大小介质粒径分布孔径大小孔径分布,常用的基本概念,固定相流动相分配系数（Cs/Cm）分辨率（Rs=1每种组分纯度为98%；Rs=1.5每种组分纯度为99.8%）容量因子（D）：固定相与流动相中溶质量的分布比分离因子（）：两种组分容量因子之比操作容量：某种组分与固定相反应达到平衡时，介质的饱和容量；通常上样量应少于20%的操作容量,速率方程各项的意义,为塔板高度,为涡流扩散相,为纵向扩散相,为固定相传质阻力相,为滞留流动相传质阻力相,为流动相传质阻力相,液相色谱系统组成,动力系统进样系统分离系统检测系统记录系统,凝胶过滤层析,Gelfiltration(Porath,Flodin,1959)Sizeexclusionchromatography(Pedersen,1962)Molecularsievechromatography(Hjertn,Mosbach,1962)Gelpermeationchromatography(Moore,1964),凝胶过滤层析的用途,分析柱用途,制备柱用途,确定分子量大小确定样品纯度研究蛋白质的结构,脱盐缓冲液置换在蛋白质分离中常作为精制步骤去除DNA，以及小分子等杂质在病毒分离中作为第一步去除大部分分子量较小的杂质,GF基本操作程序,平衡上样洗脱,一般来说上样体积应低于5%的柱体积，对于分析柱，则不超过1%的柱体积,凝胶过滤层析中的基本概念,分离度和柱效,介质的特点,琼脂糖,Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water,影响凝胶过滤层析的因素,介质种类和颗粒大小样品体积和浓度流速孔径大小,颗粒大小的影响,SuperdexPeptide13-15m,Superdex30prepgrade24-44m,样品体积对于分辨率的影响,蛋白Tf和IgG的进样体积对分离精度的影响,样品浓度的影响,使用注意事项,凝胶过滤层析最好使用进口层析柱装柱技术非常关键，有条件尽量使用预装柱对于某些分析柱，调节盐浓度可能会产生提高分辨率的效果,蛋白质的吸附解吸类层析,蛋白质与小分子吸附解吸过程的最大不同：蛋白质不同的构象之间的能量差别较大，小分子则很小或没有蛋白质吸到介质以后，除非改变流动相条件，否则不会解吸下来，会越吸牢固蛋白质更倾向于吸附机理，小分子更倾向于分配机理,平衡进料淋洗洗脱再生平衡,操作程序,离子交换层析,pH值缓冲溶液类型洗脱盐的类型,介质粒径介质孔径配基类型配基密度,影响因素,根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离,离子交换层析的用途,可用于分离纯化的各个阶段第一步最常用有时也可以用于最后一步,强和弱的区别,强弱在于它们的电荷基团完全解离的pH范围，强酸型在较大pH范围内完全解离，弱酸型完全解离的pH范围较小强酸型离子交换剂对H+的结合能力比Na+小，弱酸型则反之强碱型离子交换剂对OH-的结合能力比Cl-小，弱酸型则反之,常用的类型,葡聚糖凝胶型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂GE公司的Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂,Source系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂S系列阴离子交换树脂Q系列MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和S系列,常用的电荷基团,阴离子交换剂-Diethylaminoethyl(DEAE)-CH2CH2N+(CH2CH3)2-Quaternaryaminoethyl(QAE)-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3-Quaternaryammonium(Q)-CH2N+(CH3)3阳离子交换剂-Carboxymethyl(CM)-CH2COO-Sulphopropyl(SP)-CH2CH2CH2SO3-Methylsulphonate(S)-CH2SO3,pH值对蛋白质电荷的影响,利用pH值提高选择性,不同缓冲体系的缓冲能力,ToensureaproperpHvalue,thesampleshouldbedissolvedinbufferA,(criticalwithlargevolumesamples).Bufferingionconcentrationsof2050mMareusuallysufficient.,AU,volume,pHvalue,gradient,volume,AU,pHvalue,gradient,阴离子交换可选缓冲体系,阳离子交换可用缓冲体系,使用pH值应注意的地方,蛋白质带电不均一，pH在等电点之下时，蛋白质整体带正电，但是也存在带有负电的基团，所以也可能和阴离子交换层析发生作用；阳离子层析也是如此,pH值筛选过程,1.先考察不同蛋白质稳定的pH范围确定可使用的pH值,2.静态实验考察蛋白发生的吸附的pH值进一步缩小pH值范围,1)Put1mlionexchangerintoseveraltubes2)AddbufferswithdifferentpHs3)Addsample,mix4)AnalysethesupernatantsfortheproteinofinterestHerethetargetbindscompletelyatpH7.5andabove.Conclusion:Anionexchanger,initialpH7.5.,pH值筛选过程,3.通过层析选择最佳的pH值根据目标是分析还是分离，指标是纯度还是收率进行选择,pHscoutingfortheseparationofpancreatinConditions:System:KTAexplorer100,BufferPrepColumn:RESOURCEQ,6mlSample:2mgcrudepancreatin,不同的洗脱方式,阶跃梯度(Stepgradient)线性梯度(Lineargradient)综合pH梯度盐梯度联用pH和盐,简单，易实现标准方法，分离精度高省时、效率高很少用标准方法灵敏，但难控,蛋白质层析中的线性洗脱和阶梯洗脱,进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果,盐类型的影响,不同盐浓度具有相同洗脱力:Sulphate(SO42-)150mMChloride(Cl-)350mMAcetate(CH3COO-)700mM,阴离子对于阳离子层析，以及阳离子对阴离子层析也会有影响hofmeister效应,离子交换层析小结,原理如何筛选最佳pH值洗脱盐的影响其它操作细节（如平衡柱体积，温度，蛋白质与介质表面的接触时间等等）,疏水相互作用层析,pH值盐的类型盐的浓度,介质粒径介质孔径配基类型配基密度,影响因素,根据蛋白质与介质之间疏水相互作用的强弱进行分离,疏水层析的用途,用于分离纯化的头两个阶段最后一步很少用,疏水配基类型的影响,丁基辛基低密度苯基高密度苯基,相同配基类型，不同配基密度可使蛋白质的层析行为有很大的差别,盐浓度的影响,盐浓度过低蛋白质不能够与介质发生吸附盐浓度过高蛋白质吸附太强，在柱上变性,盐类型的影响,Cl-之前的称为kosmotropes（waterstructuremaker）,Cl-之前的称为chaotropes（waterstructurebreaker）,FranzHofmeister,FranzHofmeister(18501922),不同离子对于蛋白质沉淀的影响（1888）,对于早期的蛋白质纯化是基础性和指导性的工作,最早认识到蛋白质是由氨基酸组成的科学家（1902）,是溶液化学的基础和核心问题,HermannEmilFischer(1952-1919),证明蛋白质是由氨基酸组成的科学家（1902）,疏水层析最佳条件的选择,1考察不同盐对于蛋白质在溶液中稳定性的影响,疏水层析最佳条件的选择,2静态吸附筛选能够实现有效吸附的盐类,只有三种盐的吸附效果比较好，其它的盐虽然在溶液中对HBsAg的活性没有损失，但是对HBsAg没有明显的吸附效果,疏水层析最佳条件的选择,盐比例浓度的影响,载量的影响,盐类型的影响,盐浓度的影响,3动态层析的进一步优化,反相层析简介,反相层析和疏水层析的差别反相层析是目前分辨率最高分析类色谱,亲和层析,亲和层析是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术优点：易于分离其它方法难以分离的样品单步纯度往往可达到95%以上易于从大量杂质或类似物杂质中分离出特定目的蛋白速度快应用广泛单抗、多抗、融合蛋白、酶、DNA结合蛋白亲和层析的关键在于配基的选择,典型的洗脱图形,配基的选择,Mono-specificligandsSpecificforasinglesubstance:AntigenantibodyHormonereceptor,Group-specificligandsSpecificforagroupofstructurallyorfunctionallysimilarsubstances:LectinsglycoproteinsProteinGIgGantibodiesDye-stuffsenzymes,纯化不同物质需要不同配基,一般不具有通用性多数情况下特殊生物活性分子无现成商品介质可供使用选择合适的配基是关键,常用配基类型,基质的选择,在多孔性、稳定性、机械强度等方面与IEC等介质相同必须易于活化但又必须具有一定惰性以防非特异性吸附基质物化性质不应与配基分子键合后发生显著改变颗粒均一度要求高，以保证配体分子均匀分布,影响亲和层析的因素,基质的选择（乙肝病毒表面抗原亲和层析）配基的选择特异性、可逆性、稳定性、配基分子大小化学间臂的选择消除空间位阻、长度、亲水性,介质与配基的键合,基质表面活化-化学反应，如CNBr活化琼脂糖羟基介质活化基团与配基上的氨基、羧基、羟基、巯基或醛基等发生共价结合反应键合过程,应用实例单克隆抗体,Sample:600mlmousemonoclonalIgG2aGel:rProteinASepharoseFastFlowElution:20mMSodiumCitrate,pH4.0Result:83mgMab,recovery95%,应用实例组氨酸标记融合蛋白,Sample:5mlcytoplasmicextractcontaining(His)6-taggedGSTColumn:InHisTrapkitElution:Phosphatebuffer,500mMimidazole,pH7.4Result:4mlelutedGST-(His)6,A280:1.65.Totalamount:4.5mg,第二部分应用部分,分离纯化在生物药品中的作用,血液制品分离纯化技术是核心技术疫苗给正常人群使用，对其要求非常严格。在某些类产品中，分离纯化是技术难题生物制剂分离纯化是最关键技术之一,细胞破碎液,离心机,疏水层析,凝胶过滤层析,离子交换层析,脱盐,浓缩,纯化流程示意图,关于纯化技术认识误区,只要在蛋白上加上一个标签，就可以用金属螯合进行纯化，是否还需要其它技术？,重组技术的局限性：分子量越大的蛋白质，重组蛋白与天然蛋白在结构上的差别越大，如重组的VIII因子以及重组疫苗亲和层析技术的局限性：主要应用于实验室研究，在复杂体系中仍然会吸附其它的杂蛋白，存在着配基脱落,关于纯度的认识误区,不仅要看纯度，还要看均一性以及结构是否正确。如大肠杆菌表达产物的N端非均一性，包涵体的复性等等。纯度受分析方法精确度的限制。如说纯度达到99.9%，必须说明所采用的分析方法以供判断是否可靠分离纯化过程中纯度可用于评价分离效果但不一定代表产品质量。,蛋白质纯化的核心问题,蛋白质在纯化过程中的结构变化,HBsAg的DEAE层析谱图,HBsAg的二级结构变化,HBsAg的四级结构变化,HBsAg在界面上变化的在线监测,HBsAg纯品在离子交换层析上会分裂为两个峰，这说明其结构在层析中可能会发生变化,层析技术的分类,吸附解吸类,非吸附解吸类,离子交换层析；疏水相互作用层析；反相层析；亲和层析,凝胶过滤层析（体积排阻效应）高速逆流层析（两相分配）,优点：分辨率高缺点：存在吸附,优点：没有吸附缺点：分辨率高,蛋白质纯化与小分子纯化的差别,蛋白质分子不同构象之间存在能量差别，吸附到表面后会朝自由能减少的方向变化。若不改变洗脱条件，被吸附的蛋白质永远不会被洗脱下来。小分子不同构象之间的能量差别很小。不改变洗脱条件，小分子也能被洗脱下来，只是需要的时间比较长,进行蛋白质分离时，阶梯洗脱往往有更好的效果,温度的影响,温度对体系平衡状态有影响,温度越高对蛋白结构变化速率有影响,温度对HBsAg在层析介质表面解聚速率的影响,不同温度对于病毒颗粒纯化效果的影响,停留时间的影响,停留时间，A：0min；B：30min；C：60min；D：90min,蛋白质与介质表面接触的时间越长，发生结构变化的蛋白所占比例越多，或者发生的结构变化越明显,盐的类型和浓度的影响,Cl-之前的称为kosmotropes（waterstructuremaker）,Cl-之前的称为chaotropes（waterstructurebreaker）,盐的类型对于层析的影响非常复杂,Hofmeister序列中靠前例子容易使HBsAg在溶液中聚集，但是能够使其吸附于疏水层析介质上；序列中靠后的盐在溶液中对HBsAg稳定，但是不能够使其发生有效吸附。混合使用两种盐可以使HBsAg吸附再介质表面，又不会发生太大的结构变化,盐的类型对于HBsAg的影响,载量的影响,进料量对于HBsAg收率的影响,进料量对于HBsAg结构的影响,随着单位面积上蛋白质的吸附量，蛋白质分子之间拥挤作用可以减少其结构变化。,层析过程的放大,放大过程受到反应和传质两个方面的影响,吸附诱导的反应和蛋白与介质的接触时间有关，由体积流速决定传质包括宏观流动和分子扩散两个方面，由线性流速决定,保持柱子高度不变，扩大直径，按照线性流速放大可以保证反应和传质都不发生变化,分离纯化三步曲,综合考虑各种因素,最小化操作体积最少化操作步骤组合不同机理分离技术,重组乙肝病毒表面抗原纯化工艺,IntermediatePurification,CCS,Butul-SSephros4FF,DEAESepharoseFF,Sepharose4FF,Capture,Polishing,最终纯品的鉴定,多种手段综合表征表征,二级结构,其它性质,三级结构（侧链微环境）,四级结构,远紫外圆二色谱红外光谱拉曼光谱,凝胶过滤高效液相多角度激光散射动态光散射分析离心,荧光光谱院子外圆二色谱,二硫键、糖基化、N末端等等颗粒大小以及分布表面电势,蛋白在表面上结构的原位表征,H-D交换双偏振极化干涉原子力显微镜,几个常被忽略的注意事项,一定要先查阅文献，再开展实验。不要马上对介质和实验条件展开筛选，经过数十年的积累，很少有蛋白质的纯化工艺没有任何人做过一定要保证物料的新鲜，尤其细胞破碎液必须马上进行试验（破碎后一周后物料的层析行为与刚破碎时的差异非常大），很多实验的重复性不好不是因为介质或者缓冲液不稳定，只是物料的时间放得时间长了。缓冲溶液pH值的控制,实际工艺举例,木糖还原酶的纯化组分IV的综合利用汉逊酵母表达乙肝病毒表面抗原的纯化EV71病毒颗粒的纯化,木糖还原酶的纯化方法-1,RizziM,ErlemannP,Bui-ThanhNA,DellwegH.Xylosefermentationbyyeast4.purificationandkineticstudiesofxylosereducetasefromPichiastipitis.ApplMicrobiolBiotechnol.1988,29:148-154.,Dellweg研究小组的纯化工艺,木糖还原酶的纯化方法-2,MayrP,PetschacherB,NidetzkyB.XyloseReductasefromtheBasidiomyceteFungusCryptococcusflavus:Purification,Steady-StateKineticCharacterization,andDetailedAnalysisoftheSubstrateBindingPocketUsingStructure-ActivityRelationships.J.Biochem.2003,133:553-562.,Nidetzky研究小组的代表性纯化工艺,木糖还原酶的纯化方法-3,其他研究小组的代表性纯化工艺,GranstrmT,AiraksinenU,WuXY,LeisolaM.Candidaguilliermondiigrowsonrarepentoses-implicationsforproductionofpurexylitol.BiotechnologyLetters.2002,24:507-510.,工艺路线设计,亲和层析,优点：特异性强、纯化倍数高,缺点：自己制备,离子交换层析的优化,pH值,仅在6.5-7.5之间稳定,盐浓度,载量,再生条件,最大载量：5ml酵母培养液/ml介质,1MNaCl，20乙醇,1MNaCl，20乙醇，1MNaOH,收率由70降到50,收率可保持在70,疏水相互作用层析的优化,盐浓度,停留时间,载量,首先对介质进行筛选,Phenyl-1Phenyl-2Phenyl-3,工艺整合层析谱图,离子交换层析谱图,疏水相互作用层析谱图,介质：DEAE(生化中心)；柱子：13cm5.5cmI.D.；CV300ml流速：15ml/min；进料量：1.2-1.3L酵母培养液,介质：Phenyl（生化中心）；柱子：9cm4.0cmI.D.；CV113ml流速：15-18ml/min；进料量：1.2-1.3L酵母培养液,产品鉴定：HPSEC-UV,Conditions:TSKG3000SW(300mm7.5mmI.D.)withTSKGPWGuardcolumn(75mm7.5mm,I.D.);elutedbyPBS(0.1MPBaddedwith0.1MNa2SO4,pH6.8)atroomtemperature(20-25C)with0.5ml/minflowrate;100mlofinjectionvolume.,离子交换层析主要活性峰,疏水层析主要活性峰,产品鉴定：SDS-PAGE,1,2,3,4,1：酵母破碎液上清2：离子交换层析主要活性峰3：疏水相互作用层析主要活性峰4：marker,胶浓度：15%染色方法：银染每个条带上样量为2mg,31.0kDa,43.0kDa,66.2kDa,97.4kDa,兔肌乳酸脱氢酶的纯化Hitrap的高效使用,12345678910,所建立的工艺最终产品中含有苹果酸脱氢酶，如何去除,组分IV的综合利用提取工艺,转铁蛋白,IgG,HSA,Apo-A1,铜蓝蛋白,组分IV溶出蛋白在离子交换层析上的行为,乙肝病毒表面抗原的纯化,工作特点：用机理研究中的发现指导于实际生产中,调节溶剂环境去除表面活性剂调节盐的类型减少HBsAg在疏水层析中的损失调整整体工艺减少HBsAg在纯化过程中的聚集和解聚,EV71病毒颗粒的纯化,不同工艺制备得到的纯品分析,1-maker；2-改进后工艺；3-改进前工艺,EV71纯化工艺的建立以及纯品的获得使得后续的动物实验可以开展，推动其临床前研究,蛋白质变性,蛋白质变性过程蛋白质变性温度蛋白质在一定的温度下会变性。在一个热变性过程中，有50%的蛋白质分子变性（此时）时的温度被称为变性温度（unfolding/melting/denaturation/transitiontmeperature）。蛋白的热变性过程通常是吸热的。一些蛋白质的变性温度值列于表1中，大都在40-80之间。,蛋白质聚集,最近的研究表明聚合可能发生于蛋白质特定过渡态构象，而不是非特异性的结合。聚集过程大体分为三个步骤：引发，传递和终止。蛋白质的聚合可以有很多的物理因素诱导，比如温度，离子强度，涡流，表面或界面吸附等等。这些因素可以增加蛋白的疏水表面，会导致蛋白质的聚合。很多试剂都可以用来检测蛋白质聚合的机理。SDS，盐酸胍，脲等变性剂可以用来验证蛋白质是否为共价键聚合。用这种方法证实的非共价聚合蛋白包括胰凝乳蛋白酶原，胰岛素和白介素1。DTT，巯基乙醇等还原试剂可以用来确定蛋白质的聚合是否涉及二硫键。,Simplifiedmodelofcorrectfoldingversusmisfoldingandaggregation.Thecorrectproteinfoldingpathway(1)oftencompeteswithmisfolding(2)andaggregation(3).Aggregationoccursamongintermediateswithexposedhydrophobicpatches,whichareburiedinthecorrectlyfoldedprotein(bluelines,hydrophilicsolvent-exposedpartsoftheprotein;redlines:hydrophobicpatches).,蛋白质的化学稳定性,脱酰胺二硫键的断裂和形成水解异构化琥珀酰化非二硫键交联去糖基化美拉德反应,多种化学反应在同一蛋白质上同时发生，这使得分离和鉴定蛋白质的降解产物非常困难。纤维原细胞生长因子（bFGF），在溶液中发生多种化学变化，多聚，琥珀酰化，水解和聚合。氨基酸在蛋白质中的位置对于其化学反应性非常重要。蛋白质内部存在的水分子数量有限，如果一些氨基酸残基在蛋白内部且具有柔韧性，那么这些氨基酸残基可能具有反应性。蛋白质内部许多氨基酸的化学反应需要一定的分子柔韧性，所以变性蛋白或者具有高柔韧性的小肽分子的化学反应性要高于天然蛋白。,脱酰胺反应,Asn和Gln是蛋白质中两个最容易发生脱酰胺反应的残基，其中Asn更不稳定。蛋白质或肽的水溶液中Asn的脱酰胺的速率可以比肽键水解速率更快。,牛胰核糖核酸酶A中的Asn74的脱酰胺速率在pH5.5-7.7范围内随pH值的增加而加快。,pH值,在蛋白中的相对位置,相邻残基,人表皮生长因子（hEGF）有三个脱酰胺位点（Asn1，Asn32，Gln43），其中Asn1由于其相对较高的运动性，在中性和碱性条件下最易发生脱酰胺反应。,增加相邻氨基酸残基的尺寸和分支可以降低脱酰胺速率，最慢的反应速率是Gly为相邻氨基酸残基时脱酰胺速率的1/70,氧化,侧链中的His，Met，Cys，Trp和Tyr残基可以发生氧化反应。微量的金属离子可以催化这些位点上的氧化反应；氧化剂和光线照射可以加强氧化。,人生长激素在含有0.4%氧气的容器中即被氧化。Met容易被氧化的原因可能是它是蛋白质分子中最具柔韧性的非极性或中等极性残基。,Met中的硫醚键可以被氧化成两种形式：亚砜或砜。Met先被可逆的氧化为亚砜，在剧烈的条件下可被进一步不可逆的氧化为砜。氧化反应的速率依赖于发生反应的基团在蛋白质中的位置。人重组甲状旁腺激素中在中，Met18和Met8都可以被氧化为亚砜，但是Met18更易发生氧化。,二硫键的断裂和形成,蛋白中自由的Cys残基很容易被氧化形成二硫键连接，或者造成二硫键的交换，导致蛋白的聚集或聚合。半胱氨酸残基被埋藏于蛋白质内部，则它们很少具有反应活性。蛋白质中的巯基二硫键交换发生在离子化的巯基和二硫键之间。巯基二硫键的交换速率由亲和性巯基的带电程度决定，因此反应速率随着pH值的增加而增加，直到pH值超过巯基的pK值。即使蛋白中没有自由的Cys残基，二硫键的错位也会发生，这会导致蛋白质的聚集。比如冷冻干燥的胰岛素，它只有三个二硫键，但可以通过消除一个完整的二硫键而形成二硫键错位的聚集体。,非二硫键交联,蛋白质可以通过非二硫键的途径形成共价的二聚体或聚合物。胰岛素在存储过程中会发生这种变化。在形成胰岛素二聚体和脱酰胺胰岛素的过程中都涉及环酐中间产物。胰岛素的二聚体主要通过在AsnA-21和PheB-1之间的转酰胺基反应形成共价键。这两种胰岛素反应产物（脱酰胺基和二聚体胰岛素）相对的量在pH2.0-5.5之间随着pH不同而变化。随着pH的增加，二聚体的量增加。最近研究发现胰岛素的C端Asn在形成环酐中间产物后，可以与Phe（AspA21-PheB1）或Gly（AspA21-GlyA1）形成两种不同的二聚体。另一种非二硫键的共价交联途径是通过甲醛作为连接体交联。这种交联可以导致冷冻干燥破伤风和白喉类毒素在存储过程中发生交联，所以这引起了对福尔马林处理疫苗存储的关注。,去糖基化,蛋白质中糖链的一个功能就是保护蛋白，防止它受到热和水解而失活。例如无糖链的EPO在体内很快就被降解。对五种糖蛋白（酵母外源转化酶，牛血清胎球蛋白，黑曲霉的葡萄糖淀粉酶，卵清转铁蛋白和抗生物素蛋白，这些蛋白质中糖链所占的比例从2.2到50%。）去糖基化的研究表明去糖基化虽然对蛋白质的构象影响不大，但是Tm和变性焓H的降低说明蛋白质的稳定性降低。研究表明IFN-的去糖基化降低蛋白的活性，失活的主要原因是糖基的去除导致形成不可溶的多聚体。去糖基化也使得蛋白对于热变性更加敏感。当蛋白浓度为时，去糖基化的IFN-在63下变性，而含有糖链的IFN-在67下才会变性。,影响蛋白质稳定性的物理因素,蛋白自身性质溶液环境界面因素,结构序列、是否含有糖链、存在形式,温度、pH、盐,气-液界面、液固界面,蛋白自身性质的影响,蛋白浓度：蛋白质的聚集是与浓度相关的过程。当蛋白质浓度高于0.02mg/ml时，有利于蛋白质的聚集。蛋白聚集体的大小随着浓度的增加可能会增加，比如乳球蛋白。蛋白的来源和纯度：在中性溶液中制备的人胰岛素，其高分子量产物所占比例依据具体工艺的不同可能存在100%的差别。一个主要的影响因素是蛋白质的纯度。任何微量的酶、金属离子或者其它的污染物对蛋白质的稳定性都有影响。蛋白质的纯化过程是控制蛋白质品质最关键。蛋白质形态：结晶状态的蛋白的稳定性要高于无定形状态，对于小分子来说这种现象更为明显。37时，在的无定形胰岛素悬浮液中高聚体的形成要快于晶体胰岛素悬浮液。,溶液环境-1,温度：影响蛋白质稳定性最重要的因素就是温度。但由于蛋白质结构的复杂性，所以找不到一个能描述温度和蛋白质功能结构之间的一般性的机理。一般来说，温度越高，蛋白质越不稳定。pH值：在偏离蛋白质等电点的极端的pH条件下，蛋白质中相似电荷的斥力增加，这使得蛋白质容易变性。变性的过程降低了电荷的密度，从而降低了静电自由能。对于蛋白变性的一个次要因素是在极端pH条件下，降低了形成盐桥的能力。盐：根据盐的类型和浓度，离子作用的性质，蛋白质中的带电残基，盐对蛋白质可能起到稳定，破坏稳定或者无任何影响等效果。盐可以通过非特异性的静电屏蔽或特异性的离子结合来影响蛋白质的静电作用。,溶液环境-2,螯合试剂：与金属离子相联系，螯合试剂（比如EDTA和柠檬酸）可以通过螯合对蛋白质稳定性起关键作用的金属离子对蛋白质的稳定性起破坏作用，也可以螯合有害的金属离子从而使蛋白质稳定。蛋白质变性剂：盐酸胍，脲，硫氰酸钠和SDS常用作变性剂。这些变性剂优先与蛋白质相结合，对疏水相互作用和氢键都起到破坏作用。使蛋白完全变性的变性剂浓度对于盐酸胍是6M，对于脲是8M，,吸附、振动和剪切,吸附：蛋白质可以吸附到很多表面或者界面，比如容器的表面，空气水的界面。发生在空气水界面的蛋白质吸附首先产生一个吸附蛋白质分子的区域，接着被吸附在界面上的分子发生重排。当蛋白质发生吸附后，二级结构的变化很大，例如IgG。因此，吸附会导致蛋白质的不稳定振动和剪切：振动和剪切可以导致蛋白质的变性。振动产生疏水的空气/水界面，这可以导致蛋白质分子在界面处的富集，发生变性以使得暴露在空气中的疏水残基最大化，并且还会引起蛋白质的聚集。在振动过程中导致蛋白质聚集的疏水界面可能是气体界面也可能是液体界面。相似的，剪切也可以暴露蛋白质的疏水区域，引起蛋白质的聚集。,添加剂对于蛋白质的稳定作用1,1.缓冲溶液的稳定化作用：蛋白质只在一个狭窄的pH范围内稳定存在。但是对于缓冲溶液的选择没有一个统一的规则。对于不同的蛋白同一种缓冲体系的作用不同。但是对于缓冲溶液的选择没有一个统一的规则。2.糖和多羟基化合物：糖和多羟基化合物代表了经常用到的非特异性蛋白质稳定剂。起稳定化效果一般认为是优先排斥的结果，作用较弱而且是非特异性的。在糖类化合物中，蔗糖和海藻糖是最常用的稳定剂。蔗糖在pH6.8下，具有稳定rhDNase的效果，而且起稳定作用与蔗糖浓度有关。,添加剂对于蛋白质的稳定作用2,3.表面活性剂：表面活性剂可以分为两种类型：非离子型和离子型。这些表面活性剂可以降低蛋白质溶液的表面张力，减少蛋白质在疏水表面吸附或者聚集的驱动力。4.盐类：盐类对蛋白质稳定性的影响是非特异性的静电屏蔽，特异性的离子吸附以及它对溶剂性质的影响三种效果的平衡。5.聚合物：不同种类的聚合物都蛋白质都有稳定作用。这种稳定作用主要来自于聚合物下列性质的一个或几个：表面活性，优先排斥，对蛋白质相互作用的空间位阻效应以及增加粘度以限制蛋白的结构变化。例如：血清白蛋白用来阻止蛋白质的表面吸附，可以使蛋白稳定化。,添加剂对于蛋白质的稳定作用3,6.金属离子：一些金属离子（比如钙离子，镁离子和锌离子）可以与蛋白结合，使得蛋白结构更坚硬、致密和稳定。这也是嗜热蛋白高稳定性的一个机理。除了增加稳定性，金属离子可能也会增加蛋白质的活性，比如RNaseH。在这些金属离子中，钙离子对于许多酶在高温和低温下都是一种很好的稳定剂。7.氨基酸：某些氨基酸，单独或者与其它添加剂混合，可能通过优先排斥作用使蛋白质稳定。氨基酸可以防止rhKGF于45时，在含有5%的甘露醇的10mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中的聚集。这些氨基酸包括组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸钠、谷氨酸盐和盐酸赖氨酸。,添加剂对于蛋白质的稳定作用4,8.其它的化合物或方法：鉴定出嗜热有机体中的特定胞外积累物，我们就可以利用这种复合物作为蛋白质的稳定剂。另一种潜在的保持蛋白稳定性的方法是使用分子伴侣。减少蛋白质溶液中溶解的氧也可以减少氧导致的蛋白质氧化。9.聚乙二醇：PEG经常用作蛋白质的冷冻保护剂以及蛋白质的沉降试剂。它们具有疏水的特性，可能与蛋白侧链的疏水基团发生相互作用，从而提过蛋白的折叠程度。在较高的温度下这种特性更为明显。但是，不同分子量的PEG具有稳定某些蛋白质的作用。,PEG的作用实例,例如，45时，在含有5%甘露醇的10mM磷酸钾缓冲溶液中（pH7.0），0.2%或者1%的PEG300可以阻止rhKGF的聚集。虽然PEG200，400，600和1000降低水的表面张力，但是它们可以提高溶菌酶和BSA的稳定性。溶液中PEG对蛋白质的稳定机理还没有完全建立起来。稳定作用与具体蛋白值以及PEG的大小相关。PEG可以稳定液体的IL-1R，不同分子量PEG的稳定效果为：PEG300PEG1000PEG3350，这可能是因为PEG300的疏水性最小。另一个例子中，PEG1000和4000使得人血清蛋白不稳定，而PEG8000和10000却可以使蛋白稳定性加强。高分子量的PEG对蛋白质的稳定左右可能是因为它们对蛋白相互作用的空间位阻效应。,结构修饰对于蛋白质的稳定性1,氨基酸修饰以及位点直接突变：位点直接突变或者化学修饰可以通过突变或者封闭特定的氨基酸来改变蛋白质的稳定性。这使得易变蛋白的性质可以向嗜热蛋白的性质转变。分析氨基酸替换对蛋白质热稳定性的影响得到如下的一些参考建议：(1)保持或增强原二级结构的特性；(2)优先替换溶剂容易接近的残基；(3)在N-端引入负电荷或者在C-端引入正电荷；(4)用能够增强氢键或者范德华的残基代替原有残基；(5)能够支持附加二硫键、金属结合位点或者糖基化位点等的形成；(6)替换环中的Pro残基。,结构修饰对于蛋白质的稳定性2,糖基化:糖基化可以影响蛋白质的活性、抗原性、溶解性、抗水解能力以及稳定性。不同的糖基化形式通常具有不同的物理和化学性质。因此，可以通过糖基化来增加蛋白质的稳定性。现在，提出了一些糖基化稳定蛋白质的机理。这些机理包括与骨架肽键或者表面亲水性氨基酸形成氢键以及与相邻残基的位阻效应。这里，关键的问题是糖基化以后保持蛋白质的活性。有许多糖基化使蛋白稳定性得到提高的例子。对RNaseA进行糖基化修饰可以极大地增加其稳定性而是其活性基本不受到影响。0.3mg/ml的RNaseA在10mMPB缓冲液中（pH8.0）在90下孵育15min，其活性损失90%，但在相同条件下糖基化蛋白可以保持住75%的活性。,结构修饰对于蛋白质的稳定性3,形成二硫键:自然形成的二硫键一般都能增加蛋白质的热力学稳定性。当二硫键在序列上较远但是在距离上接近时，这种交联往往会使稳定性增加，这是因为这种交联对变性产生了物理阻碍。PEG化:将PEG修饰到蛋白质上称为蛋白质的PEG化。PEG一般连接到蛋白质中的Lys残基上。一般来说，蛋白经PEG修饰可以提高稳定性，增加溶解性，减少免疫原性，延长半衰期而且毒性很低。例如PEG20000修饰的胰岛素（insulin-Gly1-PEG20000或者insulin-Lys29-PEG20000）可以增加其在血液中对酶的稳定性。,二级结构红外光谱,确定蛋白质二级结构最常用的谱带是酰胺I带（1620-1690cm-1），酰胺III带（1200-1330cm-1）也可以用来检测蛋白质的二级结构。酰胺I带覆盖了不同二级结构的C=O伸缩振动，蛋白质中的其它结构对它没有主要的干扰带。优点是信号强，缺点是有水的干扰而酰胺III带对于二级结构具有更好的分辨率，而且没有水的影响。优点是没有水的干扰，缺点是信号弱,二级结构红外光谱,水分子在酰胺I带有强烈的吸收（1640cm-1），干扰数据分析。两种方法解决这个问题：减去水分子的吸收以及用D2O作为溶剂代替H2O。为了得到可靠的去除水分子吸收的值，要使用高的蛋白质浓度（10mg/ml）来增加蛋白质的信号，使用光路为10m或者更短的CaF2或Ba2F样品池来控制样品的吸收。用D2O作为溶剂代替H2O不但可以消除水分子在酰胺I带的强烈吸收，而且在某些情况下可以使蛋白质更加稳定。例如，人XIII因子在D2O要比H2O中更稳定。D2O中蛋白质的高稳定性是因为氘形成的氢键要比氕形成的氢键更为稳定。这意味着蛋白质在D2O的红外谱图可能与在H2O中存在差别。牛乳球蛋白在这两种溶剂中的二级结构就存在着细微的差别。,二级结构远紫外圆二色