实验六米氏常数ppt课件

实验六底物浓度对酶促反应速度的影响米氏常数的测定,1,实验目的,1.了解底物浓度对酶促反应的影响。酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶反应速度的各种因素的科学。影响酶反应速度的因素有：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。2.掌握测定米氏常数Km的原理和方法。,2,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，为一级反应。底物浓度增大与速度的增加不成正比,为混合级反应.当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,底物浓度对酶促反应速度的影响,(一)V-S曲线,底物浓度对酶促反应初速度的影响,V初,Vmax,实验原理,3,低,4,实验原理,酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：v反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；Vmax最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；S底物浓度（mol/L）；Km米氏常数（mol/L）。,（二）米氏常数,5,实验原理,这个方程表明当已知Km及Vmax时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01100mmol/L。,6,7,米氏常数的测定,基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的双倒数形式：,8,1Km11=+VVmaxSVmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定：,本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用LinewaeaverBurk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸或者L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。,9,曼尼希反应（Mannich反应）,曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物（通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成-氨基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以和带有OH（羟基）、SH（巯基）、NH2（氨基）基团的分子发生亲核加成反应，最终甲醛作为亚甲基（CH2）的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来,10,酶的Km在实际应用中的意义,鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。判断酶的最适底物（天然底物）。计算一定速度下底物浓度。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。判断反应方向或趋势。判断抑制类型。,11,实验器材及试剂,器材：50mL三角瓶、150mL三角瓶、吸管5mL，10mL、量筒100mL、25mL碱式滴定管及滴定台、蝴蝶夹、恒温水浴、滴管试剂：1040g/L酪蛋白溶液（pH8.5）、中性甲醛溶液、0.25%酚酞加50%乙醇溶液、标准0.1MNaOH溶液、胰蛋白酶溶液,12,实验步骤,1取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞（pH8-10），以0.1M标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。2量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以0.1MNaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOHmL数。,13,实验步骤,3.在1分钟、2分钟、6分钟时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOHmL数。以滴定度（即耗去的NaOHmL数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。4.然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。利用上述结果，以1/v对1/s作图，即求出Vmax与Km值。,14,实验步骤,（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各