《FCM样品制备》PPT课件

FCM的样品制备,Introduction,Content:1单分散细胞悬液制备技术2细胞生物学特征标记技术3荧光染色技术,Source:1实体组织2血液3脱落细胞4单层培养细胞,Introduction,实体组织单分散细胞的制备,Categorization:1新鲜实体组织2石蜡包埋组织,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织Definition:新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采用样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及时用固定剂或,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织Definition:低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置间过长而造成组织自溶，影响检测结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织Method:酶消化法机械法化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法protocol1将适合于酶消化的组织置于离心管中2将选好的酶溶液1-2ml加入盛有消化组织的试管中,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法protocol3一般消化20-30min(恒温37C或室温)，消化期间要间断振荡或吹打4终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法protocol5将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法principle1可以破坏组织间的胶原2可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质3可以水解组织间的粘多糖物质,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法enzyme1蛋白酶类如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够所有组织中的细胞2胰酶能水解脂键和肽键,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法enzyme3胶原酶能降解几种分子类型的胶原4溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法enzyme5弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法announcements1酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成酶效价降低2注意组织在消化液中的消化时间,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法announcements3注意酶活性的PH值如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰酶在中性溶剂中活性不佳4注意酶的适用浓度,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织酶消化法announcements5随时注意影响酶活性的其他因素6免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织Method:酶消化法机械法化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法review机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞或细胞器悬液以分散细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法review采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其他方法配合使用,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法网搓法研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法protocol,将组织块放入平皿中，加入少量的盐水用剪刀将组织剪至匀浆，加入100mlNS2用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法protocol,3离心沉淀1000rpm3-5min，再用NS洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800rpm)去除细胞碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法protocol,4以300目尼龙网过滤除去细胞团块570%冰乙醇固定，放入0-4冰箱,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法网搓法研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法网搓法protocol,将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法网搓法protocol,2把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用NS冲洗，直到将组织搓完,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法网搓法protocol,3收集细胞悬液，离心沉淀500-800rpm，2min470%乙醇固定，置0-4冰箱备用,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法网搓法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法剪碎法网搓法研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法研磨法protocol,1将组织剪至小块放入组织研磨器中，加入1-2mlNS3转动研棒，研至匀浆即可,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法研磨法protocol,4加入NS10-20ml，冲洗研器收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800rpm，1-2min，再用NS洗三次，离心沉淀,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织机械法研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织Method:酶消化法机械法化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法principle化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法principlereagent0.2%EDTAEDTA0.2g溶解后，加入Hanks液100ml，封装高压消毒，置0-4保存,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法principlereagent胰酶加EDTA胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，用时过滤,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法protocol,1将组织切成薄片放入试管加入EDTA液5ml，室温，0.5h，弃之3加入胰酶+EDTA液5-10ml，再37恒温水浴30min，间断振荡3-5次,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法protocol,4用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm，5min，再以生理盐水洗2-3次，离心500-800rpm，1-2min570%乙醇固定置冰箱中被检,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法summary,机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果，需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织化学试剂处理法summary,2酶学法、化学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的，但是会造成所测化学成分的不良影响，所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的FCM结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织announcements:,新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解,影响FCM测定结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织announcements:,2根据实验目的的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织announcements:,3酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响,需注意不同的组织选用适当的方法，如富于细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌以及一些软组织肉瘤)不一定要用酶学或化学法，往往用单独的机械法就可以受到大量单分散细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织announcements:,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织announcements:,5在使用酶学方法时要重视酶的悬液，如含有大量结缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原酶为好，因为胶原酶具有在Ca2、Mg2存在或在血清状态下不发生活性降低的特征,实体组织单分散细胞的制备,Categorization:1新鲜实体组织2石蜡包埋组织,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,Review:,FCM检测石蜡包埋组织，对其细胞的成分及特性进行定量定性分析已成为临床肿瘤学及基础生物学的主要研究对象。利用新鲜组织进行流式细胞分析，若想获得完整的科研资料是很困难的，例如患者的生存率，至少要等几年的时间,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,Review:,石蜡包埋组织细胞的FCM分析，则能在短时间内获得完整的科研资料，石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立扩大了FCM的应用范围，并有大量临床随访结果的资料重新得到研究和利用。,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,石蜡包埋组织在切片机上切取40-50m厚的组织片3-5片2将切取的组织片放入食管中3加入二甲苯5-8ml(室温)，1-2d，视石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后弃去二甲苯,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,4水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10min，去乙醇，加入蒸馏水3-5ml，10min后弃之,消化：加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37恒温水浴中消化30min，消化期间每隔10min振荡一次6消化30min后，立即加入NS终止消化经300目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以二次消化,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,7收集细胞悬液，离心沉淀1500rpm，以NS漂洗1-2次，离心沉淀1500rpm，再以NS漂洗1-2次，离心沉淀500-800rpm，去碎片,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,制备好的单细胞悬液作涂片，AO染色在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核,核发出黄绿色荧光,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,9单细胞样品1106细胞/ml，加入荧光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4冰箱30min，经500目铜网过滤后上机检测,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,announcements:,一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇，如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则没有脱净2消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,announcements:,3切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长，一般以40-50m为宜,Source:1实体组织2血液3脱落细胞4单层培养细胞,Introduction,血液单细胞样品的制备,Categorization:1淋巴细胞的制备2粒细胞的制备3单核细胞制备4骨髓细胞中白血病细胞的制备5网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:1取肝素抗凝血2.0ml，用NS2ml将全血稀释至4ml2先将3ml人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态3离心200rpm，30min，室温18-20，离心后可见试管内的血液清楚的分为4层,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:上层为血浆层，中层为分离液层(淋巴细胞所处的位置在血浆层与分离液层中间)，底层为红细胞，红细胞上为粒细胞,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:,稀释全血,分离液,离心前,离心后,血浆,淋巴细胞,粒细胞,红细胞,用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一支离心管，用NS稀释至10ml，离心洗涤2次，每次均以1500rpm,10min，弃上清后即得到纯度较高的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:,570%冰乙醇固定，置4冰箱保存,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备protocol:,血液单细胞样品的制备,Categorization:1淋巴细胞的制备2粒细胞的制备3单核细胞制备4骨髓细胞中白血病细胞的制备5网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备protocol:1用淋巴细胞分离液对细胞进行分层2粒细胞的比重较淋巴细胞稍大，因此经分离液分离后的粒细胞，分层于红细胞之上，分离液的底部,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备protocol:3以吸管慢慢将粒细胞层吸出，置另一只离心管内，以5ml的Hanks液洗涤三次，每次离心沉淀1500rpm，10min,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备protocol:4在吸取粒细胞的同时常附带一些红细胞，因此需将红细胞去除，加入1.0ml低渗溶液，30-40s5再以Hanks液洗涤2次，即可获得纯度大于95%以上的粒细胞,血液单细胞样品的制备,Categorization:1淋巴细胞的制备2粒细胞的制备3单核细胞制备4骨髓细胞中白血病细胞的制备5网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:1取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0mlNS将血稀释,均在无菌条件下操作2RPMI-1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:3放入37恒温箱内孵育30-40min,取出培养瓶,将血倾倒掉,用NS培养瓶轻轻冲洗一次,以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴附快的特点,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:而其他细胞没有这个特性,所以利用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细胞,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:4将粘附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来,用0.25%胰酶消化1015min,室温下,并不断摇震,以促使细胞脱落下,单核细胞的粘附力很强,用酶消化往往获得细胞数少,目前亦采用机械的方法,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:用一橡皮刷,伸入培养瓶在瓶壁上轻擦,将细胞刮取下,但切勿用力过大,造成细胞损伤过多5脱落下来的细胞移入离心管,离心沉淀1500rpm,5min,再以NS漂洗23次,每次离心800rpm,2min,以去除碎片杂质,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:6将细胞涂片,以盯啶橙染色,置荧光显微镜下观察形态和纯度7将细胞以70%乙醇固定,置0-4冰箱保存备检,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:,血液单细胞样品的制备,Categorization:1淋巴细胞的制备2粒细胞的制备3单核细胞制备4骨髓细胞中白血病细胞的制备5网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:,1抽取骨髓0.5ml2将0.5ml骨髓标本滴入肝素(1000u/ml)抗凝2.0mlPBS液中3再加入PBS液稀释至4ml,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:,4将稀释的4ml骨髓液缓慢加入到盛有3.0ml人类淋巴细胞分离液面之上,保持不要混合5离心沉淀2000rpm,20min,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:,6在以上条件下,将淋巴细胞、单核细胞、髓性细胞,白血病细胞与较大的红细胞,红母细胞在PBS人类淋巴细胞分离液中形成一个界面7吸去红细胞和红母细胞,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备protocol:,8以PBS液洗留下的界面上的细胞,离心1000rpm,3min9弃上清液,即可进行标记染色和流式分析,血液单细胞样品的制备,Categorization:1淋巴细胞的制备2粒细胞的制备3单核细胞制备4骨髓细胞中白血病细胞的制备5网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备protocol:,1取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/LEDTA溶液中用微量取溶器吸取50ulEDTA抗凝血置于另一离心管中，加入Goods缓冲液5.0ml，离心沉淀100Orpm，5min,连续洗三次,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备protocol:,将沉淀细胞加入1.0ml拘橡酸纳缓冲液，轻轻振荡悬浮4将悬浮液缓注入盛有4.0ml0.1%戊二醛缓冲液中固定，若即上机检测，固定15min即可,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备protocol:,如不马上检测，可固定2h后，PBS洗去固定剂，加入1.0ml拘橡酸纳缓冲液，置入4.0冰箱备检，可保存一周时间,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备protocol:,FCM分析前，用PBS洗去固定剂，加入0.5ml0.01%派若宁Y工作液，染色30min后，离心沉淀弃去染液，用PBS离心洗涤一次，1500rpm，5min，去上清液，再用PBS将细胞悬浮上机检测,Source:1实体组织2血液3脱落细胞4单层培养细胞,Introduction,脱落细胞单细胞样品的制备,Review:在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞术检测的天然样品,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization:1宫颈脱落细胞悬液的制备2食管脱落细胞悬液的制备3胸腹水脱落细胞的制备4内镜刷检样品单细胞悬液制备5冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,宫颈脱落细胞悬液的制备,Protocol:,1首先用NS冲洗宫颈表面的分泌物,以海棉轻拭宫颈表面,将海棉中吸附的脱落细胞洗脱到20mlNS中,脱落细胞单细胞样品的制备,宫颈脱落细胞悬液的制备,Protocol:,收集细胞悬液,以1500rpm离心沉淀,用NS洗涤2次,每次5min,弃上清后加入70%乙醇3ml固定备检,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization:1宫颈脱落细胞悬液的制备2食管脱落细胞悬液的制备3胸腹水脱落细胞的制备4内镜刷检样品单细胞悬液制备5冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,食管脱落细胞悬液的制备,Protocol:,将食管拉网器上的细胞洗脱到10mlNS中,以1500rpm离心沉淀,再用NS洗涤2次,离心500-800rpm，1-2min,弃上清,脱落细胞单细胞样品的制备,食管脱落细胞悬液的制备,Protocol:,调整细胞数在2X106/ml,可进行标记染色上机,如不马上检测可用70%的冰乙醇固定保存3在标记染色前如发现细胞有团块聚集，可用0.5%胃蛋白酶(PH1.5-2.0)在37水浴箱中消化5-10min，振荡分散为单细胞悬液,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization:1宫颈脱落细胞悬液的制备2食管脱落细胞悬液的制备3胸腹水脱落细胞的制备4内镜刷检样品单细胞悬液制备5冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,胸腹水脱落细胞悬液的制备,Protocol:,1抽取胸腹水200-300ml，加入抗凝剂(